眶成纤维细胞与Graves眼病患者外周血单个核细胞相互作用触发眶周重塑的体外评价

《Frontiers in Immunology》：In vitro evaluation of the interaction between orbital fibroblasts and PBMCs from Graves’ orbitopathy patients in triggering periorbital remodeling

　　

摘要翻译：背景：Graves眼病（Graves' orbitopathy, GO）是Graves病的一种并发症，以眶周组织炎症、脂肪组织扩张和纤维化为特征。免疫细胞浸润眶周组织被认为是触发该并发症的关键因素。尽管眶成纤维细胞被认为是GO发病机制中的关键细胞成分，但它们与免疫细胞的相互作用却鲜有探索。研究人员旨在体外研究自体外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）对来自活动期/非活动期、伴或不伴类固醇和维生素D3处理的GO患者的眶成纤维细胞的影响。方法：将来自活动期和非活动期GO患者的眶成纤维细胞和PBMCs在维生素D3和/或类固醇（甲泼尼龙，methylprednisolone, MP）存在的条件下共培养48小时。流式细胞术、定量PCR（quantitative PCR, qPCR）和免疫酶学评估用于评价细胞间相互作用过程中的变化。结果：研究人员发现，来自非活动期GO的眶成纤维细胞表现出更高水平的组织重塑相关基因表达。成纤维细胞与PBMCs共培养增强了成纤维细胞的增殖速率，尤其是来自活动期GO的成纤维细胞。此外，眶成纤维细胞的细胞因子分泌模式和细胞外基质成分沉积的早期变化也因疾病分期而异。另外，研究人员证明，暴露于MP可减少成纤维细胞增殖，特别是来自非活动期疾病阶段的成纤维细胞，且MP与维生素D3联合可抑制IL-6和CCL-20分泌。结论：研究人员提出，GO的发病机制涉及眶成纤维细胞和免疫细胞之间的相互作用，这种相互作用可能具有疾病分期特异性，并可由MP和维生素D3调节。

论文解读

Graves病（Graves' disease, GD）是一种器官特异性自身免疫病，以促甲状腺激素受体自身抗体导致的甲状腺功能异常为特征，是甲状腺功能亢进最常见的原因。约50%的Graves甲状腺功能亢进患者可并发Graves眼病（Graves' orbitopathy, GO），后者又称甲状腺相关眼病（thyroid eye disease, TED），表现为眼干、流泪、复视、球后压迫感、眼睑退缩和眼球突出等。严重GO约占3%–5%，可致明显疼痛、炎症、组织重塑及视神经受压等视力威胁性并发症。目前认为GO的发病受免疫、遗传和环境等多因素影响，其中眶成纤维细胞（orbital fibroblasts, OFs）因表达TSH受体而在GO发病中起关键作用。GO眼眶表现主要源于成纤维细胞增殖和脂肪生成导致的组织增大，其进展分为活动期和非活动期：活动期以炎症和成纤维细胞激活为主，非活动期以持续性组织重塑和透明质酸、胶原等细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分蓄积为特征。OFs不仅作为免疫激活的靶点，也作为塑造炎症微环境的主动参与者，与浸润的T细胞、巨噬细胞等免疫细胞相互作用，放大炎症并促进组织重塑。然而，OFs与免疫细胞之间相互作用的机制尚不明确。此外，GO的一线治疗仍为大剂量类固醇，但长期使用可致严重副作用且不能根治。因此，有必要建立体外共培养模型，研究患者自体免疫细胞与OFs的相互作用，并探索类固醇和维生素D3的调节效应。

本研究由荷兰鹿特丹眼科医院和波兰比亚韦斯托克医科大学等机构的研究人员开展。研究人员从鹿特丹眼科医院收集GO患者（每组n=5）的眶周组织和外周血，分别分离OFs和PBMCs并冻存。实验中，将OFs与严格匹配的自体PBMCs共培养48小时，并加入不同浓度甲泼尼龙（MP）和/或活性维生素D3（骨化三醇）。利用流式细胞术检测OFs增殖率和免疫细胞表型，ELISA检测培养上清中IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α、TGF-β和CCL-20浓度，qPCR检测ECM重塑、纤维化及缺氧反应相关基因表达。所有数据采用混合效应模型和Fisher最小显著性差异检验进行统计，以每位供者为实验单元。

活动期与非活动期GO患者眶成纤维细胞的基础特征：研究人员比较了两组患者OFs的基线增殖活性和基因表达。结果显示，来自非活动期GO的OFs中α平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin, αSMA）和玻璃粘连蛋白（vitronectin, VTN）表达显著高于活动期，而活动期OFs中基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）表达更高。细胞因子方面，活动期OFs的IL-1β、IL-17和TNF-α中位水平有升高趋势，非活动期则IL-6、TGF-β和CCL-20中位水平趋于升高。

活动期与非活动期GO外周血T淋巴细胞的基础特征：流式细胞术检测显示，非活动期GO患者外周血中CD4+T淋巴细胞总数、Th17（CD4+IL-17+）和Treg（CD4+Foxp3+）细胞绝对数均显著高于活动期。尽管活动期Treg绝对数较低，但这些细胞表达Foxp3的水平却更高。

活动期与非活动期GO外周血单核细胞的基础细胞因子分泌：单独培养PBMCs时，两组间Treg相关因子TGF-β和Th17相关因子IL-17的分泌水平无显著差异。

眶成纤维细胞与自体PBMCs共培养的影响：将OFs与自体PBMCs共培养后，活动期GO的OFs增殖率显著增加，但非活动期没有；同时共培养促进了OFs细胞死亡，活动期更为显著。共培养明显增强了IL-1β、IL-6、TNF-α和CCL-20的分泌，而对IL-17和TGF-β影响不明显，且两组间无统计学差异。基因表达方面，共培养显著上调活动期GO中透明质酸合成酶2（HAS2）的表达，而在非活动期GO中则显著上调COL1A1、COL12A1和MMP-9的表达。对αSMA、VTN、MMP1和MMP2表达影响较小，原有的组间差异在共培养条件下仍存在。

甲泼尼龙和维生素D3的影响：首先，OFs中糖皮质激素受体（NR3C1）和维生素D受体（VDR）表达水平在活动期与非活动期之间无差异。MP以剂量依赖方式降低活动期OFs增殖率，1 μM时抑制作用显著；非活动期OFs在共培养时对MP的抗增殖反应更为敏感。MP也剂量依赖地降低成纤维细胞活力，且在PBMCs存在时，高浓度MP的细胞毒性更明显。MP浓度依赖地降低IL-6分泌，与PBMCs共培养时降低更显著，加入维生素D3可轻微增强该效应。TNF-α仅在非活动期共培养组中呈剂量依赖性降低。TGF-β仅非活动期GO中剂量依赖下降。CCL20在两组共培养中均显著降低，活动期即使低剂量MP也明显下降，且与维生素D3无关。

甲泼尼龙和维生素D3对眶成纤维细胞重塑相关基因表达的影响：1 μM MP降低活动期OFs的αSMA表达，而在非活动期，无论有无维生素D3，PBMCs共培养均增强MP对αSMA的抑制。HAS2表达随MP剂量增加而下降，PBMCs可增强此效果。非活动期共培养的成纤维细胞中COL12A1表达随MP浓度增加而降低。MP处理后MMP1表达下降，活动期与PBMCs共培养时反应最强，维生素D3未增强该效应。MMP2表达改变在非活动期OFs中最明显，低剂量MP即可降低，加入维生素D3显著放大此效应。MMP-9在共培养细胞中随MP处理显著降低，非活动期变化更明显，维生素D3可增强MP对MMP-9的抑制作用。

讨论与结论：本研究提示，OFs活性随GO疾病分期而不同，且受免疫细胞影响；MP和维生素D3的效应也与疾病活动度相关。研究人员发现活动期GO患者PBMCs中Treg数量减少，支持眶周组织的炎症状态。共培养中PBMCs与OFs的相互作用促进了成纤维细胞扩增，改变了细胞因子释放和ECM重塑基因表达。MP可有效抑制OFs增殖，降低促炎因子和早期重塑相关基因表达，与维生素D3联用能进一步抑制IL-6和CCL-20分泌，提示维生素D3可能作为减少GO眼眶炎症的辅助治疗。本研究的局限性包括样本量小、使用总PBMCs而非特定免疫细胞亚群、仅单时间点检测以及仅评估转录水平改变。尽管如此，研究为理解GO中免疫细胞与OFs间的串扰及其分期特异性提供了重要体外证据，并支持维生素D3在GO治疗中的潜在价值。最终结论是：GO中的眼眶免疫浸润可能是加重炎症过程的关键因素；自体PBMCs与OFs的相互作用通过成纤维细胞增殖、免疫应答、细胞因子分泌和重塑相关基因表达影响疾病进展；MP能减少成纤维细胞增殖并下调早期重塑相关基因，与维生素D3联用可进一步抑制IL-6和CCL-20分泌，提示维生素D3在减少GO眼眶炎症方面具有治疗意义。