血清素受体Am5HTR2a连接神经调节与MRJP1表达及蜜蜂时间多态性

《Frontiers in Physiology》：The serotonin receptor Am5HTR2a links neuromodulation to MRJP1 expression and temporal polyethism in honey bees

　　

摘要

蜜蜂的劳动分工伴随着神经和腺体生理学的协调变化，然而神经调节信号与主要蜂王浆蛋白1（MRJP1）表达之间的分子联系仍鲜为人知。本研究表明，血清素受体Am5HTR2a与意大利蜜蜂（Apis mellifera）中哺育蜂生理学和MRJP1表达动态相关。在检测的四种血清素受体亚型中，Am5HTR2a表现出最强的年龄依赖性表达模式。其表达在哺育期（第11天）的脑中达到峰值，并在咽下腺（HG）中稍晚（第16天）达到峰值，在咽下腺中其表达从不可检测水平升至约98的峰值相对表达水平（以rp49归一化），而其他受体转录本保持相对稳定。药理学操作表明，血清素以剂量依赖性方式增加脑和咽下腺中Am5HTR2a和MRJP1的表达，而褪黑素则产生相反的效果。多因素一般线性模型确定药理学处理是Am5HTR2a表达的主要预测因子（F_2,22 = 65.31，p < 0.001，偏η2 = 0.856；每组n = 3个生物学重复），并存在显著的组织×处理交互作用（F_2,22 = 7.58，p = 0.003，偏η2 = 0.408），表明血清素能和褪黑素能效应在神经组织和外分泌组织之间有所不同。一致地，用5,7-二羟色胺消耗内源性血清素可降低MRJP1表达。RNA干扰介导的Am5HTR2a敲低有效抑制了受体转录本丰度，并伴随MRJP1 mRNA的进行性下降。值得注意的是，血清素仍能以剂量依赖性方式提高采集蜂中的MRJP1表达，表明血清素能反应性在哺育阶段之后仍然存在，并且时间多态性的某些方面在生理学上保持可逆性。综上所述，这些结果确定了Am5HTR2a是与工蜂生理学和咽下腺相关MRJP1表达相关的血清素能信号通路的一个组成部分。这些发现支持一个模型，在该模型中血清素能和褪黑素能信号可能与芳基烷基胺N-乙酰转移酶（AANAT）依赖的吲哚胺代谢相关，尽管本研究未直接测量AANAT活性。在此框架下，这些信号通过调节潜藏在工蜂分配至行为和代谢任务中的分子程序，帮助塑造时间多态性。

论文解读

**一、研究背景与问题提出**

蜜蜂（Apis mellifera）是典型的社会性昆虫，其劳动分工是社会组织的重要特征。工蜂在成年后经历一系列与年龄相关的行为转变，即时间多态性（temporal polyethism）：年轻工蜂通常在巢内从事哺育幼虫和加工食物等任务，随后在生命后期转变为外出采集花蜜和花粉的采集蜂。这一行为转变具有高度可塑性，受群体需求、营养状态、内分泌信号和环境输入等多重因素的综合调控。伴随行为转变，工蜂体内发生广泛的生理变化，包括咽下腺（hypopharyngeal glands, HG）的重塑、代谢的改变以及神经调节信号通路的变化。

咽下腺是哺育蜂生理的核心器官，负责合成和分泌蜂王浆——富含蛋白质的幼虫食物，对幼虫营养和蜂王发育至关重要。在哺育阶段，咽下腺表现出高分泌活性并大量产生主要蜂王浆蛋白（major royal jelly proteins, MRJPs），而当工蜂转向采集行为时，腺体活性显著下降。在MRJPs中，MRJP1（历史上曾被称为“royalactin”，即RA）尤其受到关注，有研究报道其对蜜蜂幼虫的蜂王发育相关性状具有贡献，并在果蝇中通过EGFR相关信号通路增加体型、繁殖力和寿命。然而后续研究强调，级型分化不能归因于单一因素，而是营养、内分泌调节、代谢和表观遗传机制相互作用的结果。尽管MRJP1在级型决定中的作用仍存在争议，但其表达与哺育蜂的咽下腺功能和蜂王浆生产密切相关，反映出它参与了更广泛的营养基因组和内分泌调控网络。

工蜂行为成熟受多种内分泌和神经调节系统协调。保幼激素（juvenile hormone, JH）与从哺育到采集的行为转变密切相关，而卵黄原蛋白（vitellogenin）和营养信号通路与育雏生理和代谢状态相关联。生物胺类神经递质在调节蜜蜂的感觉反应、运动、学习、摄食行为和任务分配中也发挥重要作用。其中，血清素（5-羟色胺；5-HT）因其在中枢神经系统和外周组织中的广泛功能，被认为是行为和生理可塑性的候选调节因子。蜜蜂拥有四种分子特征明确的血清素受体亚型：Am5HTR1、Am5HTR2a、Am5HTR2b和Am5HTR7。已有研究表明，Am5HTR2受体在蜜蜂脑和包括咽下腺在内的外分泌组织中广泛表达，在咽下腺中转录水平特别高，提示其在整合神经活动与外周分泌功能方面具有潜在作用。

虽然工蜂行为成熟的内分泌调节已被广泛研究，但连接神经调节信号与咽下腺相关蜂王浆生产的分子通路仍不清楚。特别是，血清素信号是否直接参与调节从哺育到采集转变过程中MRJP1的表达，这一问题尚未解决。本研究正是基于这一关键科学问题展开，旨在探究血清素信号通路在蜜蜂时间多态性中对MRJP1表达的调控机制。

**二、研究内容与技术方法**

该研究采用多层次的实验策略，系统探究了血清素信号通路与MRJP1表达之间的关系。主要技术方法包括：利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测不同发育时间点脑和咽下腺中四种血清素受体基因的表达谱；通过显微注射外源血清素、褪黑素及血清素神经毒素5,7-二羟色胺（5,7-DHT）进行药理学操作；采用RNA干扰（RNAi）技术特异性敲低Am5HTR2a基因表达；运用多因素一般线性模型（GLM）统计分析方法评估组织类型、工蜂年龄和药理学处理对Am5HTR2a表达的相对贡献。蜜蜂样本采集自日本神户大学实验园饲养的意大利金黄品种蜂群，所有蜜蜂来自单一源蜂群，观察蜂箱由主蜂群蜂王的姐妹蜂王统领。

**三、主要研究结果**

**1. 血清素受体基因在脑和咽下腺中的个体发育表达谱**

研究人员对四种血清素受体亚型（Am5HTR1、Am5HTR7、Am5HTR2a和Am5HTR2b）在脑中的表达进行了六个时间点（第3、6、11、16、21和23天）的定量分析。结果显示，Am5HTR2a展现出最显著和动态的年龄依赖性表达模式：第3天表达较低（0.60 ± 0.10），第6天迅速升高至2.50 ± 0.30，第11天达到峰值（6.30 ± 0.50），恰逢哺育蜂阶段；第16天仍保持较高水平（5.80 ± 0.40），随后在通常与采集转变相关的第21天急剧下降至1.00 ± 0.20，第23天降至最低点（0.50 ± 0.15）。双因素方差分析显示显著的基因×日龄交互作用。相比之下，其他三种受体亚型在成虫寿命期间表达相对稳定。咽下腺中Am5HTR2a的表达与脑中时间谱相似但更为显著：第3天不可检测，第6天大幅上升（58.00 ± 5.00），第16天达到峰值（98.00 ± 5.00），第21天回落至不可检测水平。咽下腺中Am5HTR2a的峰值表达（约98）远高于脑（约6.3）。

**2. Am5HTR2a表达的多因素决定因素**

通过拟合一般线性模型（GLM），研究人员发现药理学处理是Am5HTR2a表达的最强预测因子，解释了约85.6%的方差（F_2,22 = 65.310，p < 0.001，偏η2 = 0.856）。组织类型（脑 vs. 咽下腺）和工蜂年龄（第11天 vs. 第21天）也分别产生显著的主效应，均属于大效应量。值得注意的是，组织×处理交互作用显著（F_2,22 = 7.580，p = 0.003，偏η2 = 0.408），表明处理对Am5HTR2a表达的效应幅度在脑和咽下腺之间存在差异。事后比较显示，在哺育蜂脑中，血清素注射显著上调Am5HTR2a表达（7.80 ± 0.87 vs. 对照6.30 ± 0.69），而褪黑素处理则将其抑制至1.20 ± 0.35，较对照降低约81%。在采集蜂脑中，血清素同样诱导Am5HTR2a显著上调（8.00 ± 0.87 vs. 对照4.20 ± 0.69）。咽下腺中观察到了类似的趋势。

**3. RNAi介导的Am5HTR2a敲低及其时间动态**

为功能验证Am5HTR2a在下游基因调控中的作用，研究人员对11日龄哺育蜂注射了dsRNA-Am5HTR2a，并在注射后0、24、48和72小时监测受体表达。双因素方差分析显示处理、时间及其交互作用均极显著。注射后48小时，dsRNA处理组Am5HTR2a表达较对照组显著下降（2.80 ± 0.52 vs. 6.00 ± 0.69）；72小时进一步降至0.50 ± 0.35，较对照降低超过90%。

**4. Am5HTR2a敲低对MRJP1表达的 downstream 效应**

在同一时间进程中检测MRJP1表达发现，单因素方差分析显示时间效应极显著（F_3,8 = 26.608，p < 0.001）。MRJP1表达从0小时的98.00 ± 10.39逐步下降至24小时的62.00 ± 8.66、48小时的48.00 ± 8.66和72小时的35.00 ± 8.66，累计降低64.3%。这建立了Am5HTR2a表达与MRJP1转录调控之间的功能联系。

**5. 血清素和褪黑素对MRJP1表达的药理学调节**

对11日龄哺育蜂注射梯度剂量（0.1、1和10 pmol）的血清素或褪黑素后，双因素方差分析显示处理效应极显著（F_7,32 = 92.460，p < 0.001），但组织效应和组织×处理交互作用不显著。在脑中，血清素以剂量依赖方式上调MRJP1表达，10 pmol剂量使表达从对照的4.50 ± 0.52升至9.00 ± 0.87；而所有剂量的褪黑素均将MRJP1表达抑制至0.30–0.50，较对照降低超过90%。咽下腺中观察到类似的剂量依赖性上调模式和褪黑素抑制效应。

**6. 血清素处理的年龄依赖性剂量反应**

为确定血清素介导的MRJP1上调是否仅限于哺育蜂，研究人员对21日龄采集蜂注射了相同剂量梯度的血清素。双因素方差分析显示组织（F_1,20 = 7.712，p = 0.012）、处理（F_3,20 = 51.683，p < 0.001）以及组织×处理交互作用（F_3,20 = 8.687，p < 0.001）均显著。采集蜂脑中的基线MRJP1表达（0.50 ± 0.35）远低于哺育蜂（4.50 ± 0.52），但血清素能够以剂量依赖方式恢复MRJP1表达：10 pmol剂量使脑中表达显著升至7.20 ± 0.87，咽下腺中升至5.00 ± 0.87。

**7. 血清素消耗对MRJP1表达的影响**

用选择性血清素能神经毒素5,7-DHT处理11日龄哺育蜂后，双因素方差分析显示处理效应显著（F_3,20 = 9.617，p < 0.001），组织效应和交互作用不显著。脑中MRJP1表达从对照的100.00 ± 13.86降至10 pmol剂量下的45.00 ± 13.86（减少55%）；咽下腺中从98.00 ± 17.32降至35.00 ± 25.98（减少64.3%）。这些结果为内源性血清素维持MRJP1转录提供了收敛的药理学证据。

**四、讨论与结论**

讨论部分指出，Am5HTR2a的表达与工蜂行为成熟和MRJP1丰度密切相关，其年龄依赖性模式与咽下腺活跃分泌期和蜂王浆生产期平行。血清素处理同时上调Am5HTR2a和MRJP1，而褪黑素则相反；RNAi敲低和血清素消耗均一致降低MRJP1表达。值得注意的是，血清素即使在采集蜂中仍能恢复MRJP1表达，表明血清素能反应系统在行为成熟期间未被不可逆地沉默，可能保留了对群体需求做出情境依赖性再激活的能力。

研究人员提出，Am5HTR2a作为Gαq/11偶联受体，能够动员细胞内Ca²⁺储存——已知可刺激昆虫外分泌腺分泌活性的信号级联——可能通过尚未识别的Ca²⁺依赖性转录因子（如CREB）介导血清素诱导的MRJP1合成。褪黑素通过芳基烷基胺途径在血清素下游产生，一贯对抗血清素的效应，表明这两种吲哚胺信号在塑造从哺育到采集转变中具有相互关系。研究还讨论了与保幼激素和卵黄原蛋白等已确立的内分泌调节因子整合的可能性，并承认了多项方法学限制，包括样本量小、rp49未在发育系列中正式验证、行为状态由日历年龄推断、未检测蛋白质水平以及RNAi潜在脱靶效应等。

研究结论为：Am5HTR2a是一种血清素受体亚型，其表达与哺育蜂阶段以及脑和咽下腺组织中的MRJP1转录密切相关。来自发育谱分析、药理学操作、内源性神经递质消耗和RNAi的收敛证据支持存在一条维持育雏食物生产相关分子和生理状态的血清素能信号轴。采集蜂中血清素反应性的持续存在及其剂量依赖性恢复MRJP1表达的能力表明，该通路在行为成熟期间未被不可逆地沉默，而可能保持对群体需求做出情境依赖性再激活的准备状态。这些发现将神经调节信号置于时间多态性的更广泛框架中，与保幼激素和卵黄原蛋白等已确立的内分泌调节因子并列。该研究发表在《Frontiers in Physiology》期刊上，为理解蜜蜂劳动分工的分子机制提供了重要见解。