环肽161通过MEK1/2–ERK1/2信号通路保护人真皮成纤维细胞抵御紫外线诱导损伤

《Frontiers in Physiology》：Cyclopeptide 161 protects human dermal fibroblasts against UV-induced damage via the MEK1/2–ERK1/2 signaling pathway

　　

背景：皮肤稳态持续受到紫外线（Ultraviolet, UV）照射扰动，可引发细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）结构紊乱、成纤维细胞衰老及真皮完整性退化。环肽161（Cyclopeptide 161, CP161）为合成环六肽，已有文献记载其可上调胶原基因转录，但其更广的皮肤生物活性及皮肤调控作用的精确分子机制大多未明。方法：研究人员首先在经紫外辐射的原代人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts, HDFs）中表征CP161的皮肤保护潜力，依托RT-qPCR、Western blot、SA-β-gal染色及细胞内活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）定量进行表型验证；利用无标记定量蛋白质组学绘制CP161处理后核心生物学事件与信号网络，并采用细胞热位移 assay（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）、生物膜干涉（Biolayer Interferometry, BLI）、分子对接及分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟验证CP161能否物理结合MAP2K1；进一步在培养胆碱能神经元和戊四氮（Pentylenetetrazole, PTZ）刺激斑马鱼幼虫中量化乙酰胆碱（Acetylcholine, ACh）分泌与过度神经肌肉活动，并以CETSA、分子对接和MD模拟检验CP161与Munc18a的直接结合。结果：在UVA照射HDFs中，CP161恢复COL1A1、COL14A1与COL16A1表达，抑制MMP1和p21上调，减少SA-β-gal阳性细胞，降低细胞内ROS积累；蛋白质组学显示ECM组织协同重塑；CP161减弱UVA诱导的MEK1/2–ERK1/2磷酸化，CETSA、BLI、分子对接与MD分析共同支持CP161与MAP2K1直接互作；在胆碱能神经元中CP161减少诱发ACh释放，在PTZ斑马鱼幼虫中剂量依赖减轻神经肌肉过度活动，并获CP161与Munc18a直接互作证据。结论：CP161通过直接结合MAP2K1并减弱MEK1/2–ERK1/2信号级联保护HDFs免受UVA损伤，从而维持ECM稳态，为环肽皮肤保护活性建立机制框架，并确定MAP2K1–ERK1/2轴为核心通路。

研究背景方面，皮肤是机体与环境的主要屏障，其稳态持续受外源有害刺激与内源机械张力扰动。紫外线（Ultraviolet, UV）辐射是皮肤光老化的主导触发因素，可导致真皮细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）渐进性紊乱、纤维胶原碎裂、弹性组织变性、衰老成纤维细胞累积及真皮机械完整性丧失。真皮成纤维细胞合成大部分ECM成分并感知机械与氧化信号，其功能衰退驱动皮肤衰老可见表现。分子层面上，UVA照射经光化学与线粒体、NADPH氧化酶来源产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），促使受体酪氨酸激酶配体非依赖激活，启动MEK（MAP2K1/2）–ERK1/2级联，诱导基质金属蛋白酶1（Matrix Metalloproteinase 1, MMP1）、p21并抑制COL1A1、COL14A1、COL16A1等胶原基因。MAP2K1处于限速节点，肿瘤学MEK抑制剂皮肤毒性大，难以用于美容或普通皮肤科；植物化合物VB1可结合MAPK1/ERK2，但合成环肽是否作用于该级联其他节点尚属空白。CP161（Cyclo(His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-)）系合成环六肽，专利披露促胶原相关基因表达，但机制与分子靶点未定义。另有实验室观察提示CP161调节胆碱能神经元诱发递质释放；Munc18a（STXBP1）为SNARE复合体组装的必需Sec1/Munc18家族调控蛋白，面肌反复收缩经神经肌肉接头ACh释放造成真皮机械应变，故CP161若结合Munc18a可软化真皮神经肌肉驱动。该研究即界定CP161在UVA损伤HDFs中的分子基础，并扩展其胆碱能神经生物活性。

主要关键技术方法方面，研究人员以原代人真皮成纤维细胞（Human Dermal Fibroblasts, HDFs）、海马神经元细胞及5 dpf斑马鱼幼虫为样本体系；以无标记定量蛋白质组学绘制ECM相关网络，以细胞热位移 assay（Cellular Thermal Shift Assay, CETSA）做蛋白组范围热稳定性靶标筛查，以生物膜干涉（Biolayer Interferometry, BLI）测CP161与MAP2K1、Munc18a结合亲和力，以分子对接与分子动力学（Molecular Dynamics, MD）模拟解析结合界面与复合物稳定性，以RT-qPCR和Western blot读ECM与MAPK节点，以SA-β-gal和ROS流式评衰老与氧化应激，以ACh检测与PTZ斑马鱼运动追踪评神经肌肉活性。

研究结果部分，3.1 CP161缓解UVA诱导的HDFs衰老与氧化应激：经CCK-8确认CP161在0.031–1 mg/mL、24/48 h无细胞毒，SA-β-gal显示UVA升衰老细胞比例、CP161（10、60、100 μg/mL）显著回降，DCFH-DA流式示ROS降低，DPPH实验示其具浓度依赖自由基清除能力。

3.2 CP161促进ECM相关基因表达并抑制MMP1与p21：qPCR示UVA抑COL1A1、COL14A1、COL16A1，CP161（10、60 μg/mL）恢复其mRNA；Western blot示UVA升MMP1、p21，CP161（1 mg/mL及剂量梯度）抑制其蛋白，说明调控具浓度依赖且非高剂量非特异性。

3.3 定量蛋白质组学揭示CP161调控ECM组织与基质相关网络：BC、NC、CP161三组DIA质谱显示DEPs显著重排，GO富集集中于细胞外区域/ECM，GSEA显著富集REACTOME EXTRACELLULAR MATRIX ORGANIZATION、COLLAGEN CONTAINING EXTRACELLULAR MATRIX与WOUND HEALING，印证胶原转录恢复并非孤立事件。

3.4 CP161直接结合MAP2K1：HDF裂解液CETSA中MAP2K1熔解温度由50.94 °C移至57.73 °C；BLI得CP161–MAP2K1平衡解离常数K_D为1.956×10^?4 M；分子对接定位于Asp152周边口袋，结合能?4.847 kcal/mol；75 ns MD中RMSD稳于1.48±0.10 ?，MM-PBSA ΔG为?39.82±15.26 kcal/mol，证其为直接结合伙伴。

3.5 CP161抑制UVA诱导MAPK级联：Western blot示UVA升MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2，CP161（1 mg/mL及10–500 μg/mL）抑磷酸化形式，证实结合MAP2K1转化为下游MAPK信号功能抑制。

3.6 CP161抑制ACh释放与PTZ诱导过度活动：海马神经元中CP161 50、100 μg/mL降上清ACh约25%–30%；7.5 mM PTZ斑马鱼幼虫中CP161 10–100 μg/mL剂量依赖抑运动，25 μg/mL以上近基线，说明体外胆碱能抑制具体内神经肌肉表型对应。

3.7 CP161直接结合Munc18a并形成稳定界面：BLI得CP161–Munc18a K_D为1.207×10^?6 M；对接置于Munc18a域3a/Syntaxin-1 H3界面、近Ser43，结合能?7.523 kcal/mol；75 ns MD中RMSD均值1.91±0.20 ?，MM-PBSA ΔG为?36.17±12.11 kcal/mol，支撑其占用SNARE结合界面、弱化诱发胞吐。

讨论部分总结方面，研究人员指出皮肤衰老是UVA氧化应激—MAPK持续激活—MMP上调—胶原抑制—衰老成纤维细胞累积的自强化回路；CP161直击MAP2K1这一限速节点，使COL1A1/COL14A1/COL16A1恢复、MMP1与p21下降、SA-β-gal减少，属上游重置基质稳态而非单点ECM组分修饰。总MEK/ERK与磷酸化同步升高源于重复UVA与累积剂量下AP-1转录扩容及氧化应激损及蛋白酶体周转，CP161抑磷酸化仍明确。K_D约196 μM看似温和，但环肽作用于蛋白–蛋白界面、经MEK/ERK信号放大即可在低工作浓度获强表型。Munc18a活性与面肌收缩机械伤互补：生化UVA损伤与生物力学收缩损伤双轴可被同一环肽覆盖。局限包括裂解液CETSA非活细胞、HDF体系不捕Munc18a、结论待皮肤外植体/3D皮肤等效物/体内光老化模型验证。

研究结论部分翻译：CP161通过直接结合MAP2K1并减弱MEK1/2–ERK1/2信号级联，保护人真皮成纤维细胞免受UVA诱导损伤，从而维持细胞外基质（ECM）稳态。这些发现为CP161皮肤保护活性建立了机制框架，并将MAP2K1–ERK1/2轴确定为该环六肽维持真皮稳态所经由的主导通路。该论文发表于《Frontiers in Physiology》。