血管内免疫细胞标记作为表征EAE中肺组织CD4+ T细胞的关键方法学工具

《Frontiers in Immunology》：Intravascular immune cell labeling as a critical methodological tool for characterizing CD4+ T cells in the lung in EAE

　　

引言：越来越多证据提示肺-脑轴（lung-brain axis）是中枢神经系统（central nervous system，CNS）自身免疫的重要贡献者。然而，肺免疫细胞准确定义存在技术难题，因为标准经心脏灌注（transcardial perfusion）不能清除肺内大量边集血管内白细胞池，使循环细胞污染肺实质分析。 方法：研究人员用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35-55肽加完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant，CFA）免疫小鼠诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE），并给百日咳毒素（pertussis toxin）。在处死前静脉注射荧光偶联抗CD45抗体进行血管内（intravascular，IV）标记，经经心脏灌注和酶解后分离肺单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）。通过多色流式细胞术（multicolor flow cytometry）结合体外刺激和胞内染色分析免疫细胞群及胞内细胞因子。 结果：研究人员在处死前3分钟静脉注射荧光标记抗CD45抗体。尽管充分经心脏灌注，分离出的肺白细胞中73–85%为IV标记阳性，说明血管内细胞大量残留。真正肺实质（IV-）CD4+ T细胞在幼稚和EAE小鼠中均富集效应记忆表型，高表达组织驻留相关标志CD69和CD11a，并经体外刺激后产生更多IL-17、GM-CSF和IFN-γ。IV+肺血管CD4+ T细胞近似外周血CD4+ T细胞，但部分转录因子和细胞因子表达略升高。 讨论：结果表明仅用经心脏灌注不足以区分肺实质与血管内免疫细胞。研究人员提出体内血管内标记应作为研究肺免疫应答的方法学标准。

研究背景：中枢神经系统（central nervous system，CNS）曾被认为具有免疫特许性，但致病性T细胞浸润是多发性硬化（multiple sclerosis，MS）及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）的核心特征。新兴的“枢纽-辐条（Hub-and-Spoke）”范式认为，效应CD4⁺ T细胞可在肺等非淋巴外周器官中获得许可、代谢适应和转录重编程，再迁移至CNS。神经炎症时，自身反应性T细胞在肺微环境聚集并获得产生IL-17和GM-CSF的致病效应记忆表型。然而，肺高度血管化，常规经心脏灌注（transcardial perfusion）和组织解离不能可靠区分真正肺实质（parenchymal，Par）免疫细胞与大量边集血管内（intravascular，IV）白细胞池；文献报道标准灌注后仍有约74%–97%回收肺白细胞位于肺血管。虽血管内抗体标记在黏膜免疫学中广受认可，但研究EAE中肺-脑轴（lung-brain axis）的论文几乎仍只靠经心脏灌注。因此，引入IV-CD45染色对避免把边集血管细胞误归为肺实质、准确界定肺病免疫T细胞至关重要。该研究本身并不重新证明肺-脑轴存在，而是评估在神经炎症下用体内血管内标记区分真正肺实质CD4⁺ T细胞应答与边集血管污染物的必要方法学问题。论文发表于《Frontiers in Immunology》。

主要关键技术方法：研究人员使用3月龄雄雌各半的C57BL/6小鼠，设幼稚组与EAE组，每组每批4只、性别匹配，独立重复两次。EAE组以MOG_35-55肽乳化物皮下免疫并腹腔注射百日咳毒素。处死前3分钟尾静脉或静脉注入BV421-抗CD45抗体，随后经心脏冷PBS灌注，取肺酶解并去除碎片获得单个核细胞（mononuclear cells，MNCs）。以另一荧光抗CD45抗体体外复染，用多色流式细胞术分IV⁺与Par（IV^-）细胞；胞内因子检测采用PMA/离子霉素刺激加蛋白转运阻断后固定透染。统计用单因素方差分析与Tukey事后检验。

研究结果：

3 Results

在峰值EAE（免疫后20天）小鼠中，静脉给BV421-抗CD45后即使充分灌注，IV CD45⁺细胞仍占回收单个核细胞的73–85%（个体最小值到最大值）。这说明肺分离细胞中大量仍位于肺血管。进一步看，肺实质CD4⁺ T细胞比IV细胞和外周血细胞频率更高，且效应记忆（effector-memory，E.M.）表型、CD69与CD11a组织驻留标志显著升高。常规（Foxp3^-）CD4⁺ T细胞中，Par组产生IL-17、GM-CSF、IFN-γ更多；RORγt趋势与细胞因子一致。Foxp3⁺调节性CD4⁺ T细胞在IV组频率高于Par和外周血，但IL-10产生无显著改变。IV标记CD4⁺ T细胞虽接近外周血，但RORγt和Foxp3略高，提示肺IV区不是体循环被动延伸，而是含更多边集效应细胞。

在幼稚小鼠中，Par、IV、外周血CD4⁺ T细胞总体频率无显著差异，但表型同EAE相似：Par细胞高表达CD69、CD11a并具更强E.M.表型；刺激后Par常规CD4⁺ T细胞IL-17、GM-CSF、IFN-γ、RORγt更高，Par调节亚群Foxp3⁺频率和IL-10也更高。IV细胞呈中间表型，更接近外周血而略有肺血管边集特征。

4 Discussion

研究人员指出，经心脏灌注因肺循环短路、塌陷肺泡毛细血管物理困滞、边集细胞与内皮黏附等，不能清除残留血管白细胞。体内IV标记用处死前注射荧光抗CD45，可清晰分开循环与实质CD4⁺ T细胞：Par细胞富集E.M.、高表达组织驻留标志、体外刺激后效应功能更强；忽略这些顽固IV污染物会严重混淆肺局部免疫分析，在解释肺-脑轴中肺CD4⁺ T细胞作用时尤为关键。IV细胞近似外周血但非完全相同，反映肺毛细血管床低压力微血管作为活化淋巴细胞短暂滞留库。研究人员也承认EAE相关血管炎症可能增加通透性，3分钟短标记虽使IV⁺与IV^-分界清楚、未见广泛中间染色，但仍不能仅靠流式完全排除少量抗体外渗。

研究结论部分翻译：尽管经心脏灌注被广泛用于清除肺内血源细胞，本研究与既往报道一致，证明单纯静水冲洗不足以消除IV污染。由于肺循环解剖短路、塌陷肺泡毛细血管中的物理困滞，以及边集免疫细胞与血管内皮的牢固黏附，标准经心脏灌注后残留血管白细胞常持续存在。为准确区分真正实质细胞与这些残留IV白细胞，研究人员采用处死前给予荧光偶联抗CD45抗体的体内IV标记策略。由此在幼稚和EAE小鼠中识别出循环与实质CD4⁺ T细胞群在表型和功能上的显著差异。肺实质CD4⁺ T细胞富集E.M.表型，组织驻留标志表达更高，体外刺激后效应功能远强于循环对应细胞。总之，不考虑这些顽固IV污染物会严重混淆肺局部免疫分析，在解读肺-脑轴背景下肺CD4⁺ T细胞参与时尤其关键。IV标记CD4⁺ T细胞表型更接近外周血区室，仅与实质区有有限相似；这种中间表型可能反映肺毛细血管床独特结构中的白细胞边集。肺低压力微血管网络作为生理储库，因活化淋巴细胞变形性下降和黏附分子上调而短暂滞留。综上，仅标准灌注后分析肺分离免疫细胞不能完整呈现动态肺免疫图景，凸显体内IV标记对准确区分IV与实质区室的必要性。研究人员还说明，EAE相关血管通透性和炎症可能影响IV抗体标记效率；3分钟短标记旨在优先标记血管腔白细胞、减少组织外渗，流式上IV⁺与IV^-分离清晰、CD69/CD11a高表达主要在IV^-实质CD4⁺ T细胞，但无法仅凭流式彻底排除有限抗体外渗。