LC-MS/MS测定大鼠生物基质中新型抗肝癌候选药物ETN101及其两种代谢物用于ADME表征

《Frontiers in Pharmacology》：Determination of ETN101, a novel anti-hepatic cancer agent and its two metabolites in rat biological matrices using LC-MS/MS for ADME characterization

　　

ETN101是一种具有抗肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）活性的新治疗候选物。研究人员开发了三种互补的液相色谱-串联质谱（liquid chromatography–tandem mass spectrometry，LC–MS/MS）方法，采用蛋白沉淀和基质匹配校准，用于定量大鼠血浆、组织匀浆、尿液和粪便中ETN101及其代谢物M1和M2。方法参照美国食品药品监督管理局（FDA）和国际人用药品注册技术协调会（ICH）M10指南验证。血浆、尿液和粪便采用同步 assay；组织匀浆采用两套LC–MS/MS系统。血浆校准范围：ETN101为2–2,000 ng/mL，M1和M2为0.2–2,000 ng/mL；组织匀浆分别为50–5,000 ng/mL和5–500 ng/mL；尿液和粪便分别为20–2,000 ng/mL和2–2,000 ng/mL。各基质内日间和日内准确度87.4%–115.7%，精密度≤15.0%，提取回收率56.8%–104.8%。绝对基质效应随基质变化，但在6个个体批间可重复（变异系数≤15%），稳定性符合预设标准。方法用于大鼠ADME研究：20 mg/kg每日一次口服5天，ETN101吸收缓慢，M1和M2存在于血浆并与母体药并行下降；第1日和第5日0–24 h全身暴露无显著空腹-进食差异；M2系统暴露高于M1。ETN101和M2在所有受检组织可定量，M1在脑和脂肪常低于定量下限（LLOQ）。ETN101组织-血浆浓度比（Kp）以肺和肾最高。静脉10 mg/kg后，尿回收各分析物≤0.03%，粪回收ETN101、M1、M2分别为0.25%、0.76%、2.21%，合计约3.3%。方法可按研究目的选用，适用于ETN101临床前药代和ADME研究。

研究背景方面，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常见原发性肝癌，进展快、转移率高，晚期治疗选择有限；索拉非尼等多激酶抑制剂易产生耐药，免疫联合抗血管生成疗法也常因原发或继发耐药而进展。ETN101（又称MBP-11901）是可抑制VEGFR2介导信号的新候选物，体外具抗增殖和促凋亡作用。已有研究在人类、小鼠、大鼠、犬和猴肝细胞中发现34种代谢物，其中M1（CJM-126，酰胺水解产物）和M2（N-乙酰-CJM-126，经NAT1/NAT2乙酰化产物）为关键代谢物；但此前无定量大鼠血浆、组织、尿液和粪便中ETN101、M1、M2的生物分析方法。为支持临床前药代与ADME评价，研究人员开发并验证LC–MS/MS方法，并用于大鼠体内过程表征。该研究论文发表于《Frontiers in Pharmacology》。

关键技术方法上，研究人员以雄性Sprague-Dawley大鼠为样本动物来源，分别开展：重复口服20 mg/kg每日一次共5天的药代与组织分布研究，第5日24 h灌注取肝、肺、肾、脑、心、脾、睾丸、甲状腺、胃、小肠、大肠、脂肪、肌肉等13类组织；单剂静脉10 mg/kg排泄研究，分时段收集0–144 h尿粪。分析上采用三种LC–MS/MS方法：血浆/尿/粪同步测定ETN101、M1、M2（Agilent 1290 UPLC+6495三重四极杆，Poroshell 120 SB-Aq柱，梯度洗脱，内标amlodipine）；组织ETN101单独测定（同系统改梯度）；组织M1/M2用Agilent 1100 HPLC+SCIEX API 4000，Luna Omega PS C18柱，等度洗脱，内标glipizide。样品处理以蛋白沉淀为主，血浆单步、组织/尿/粪双步甲醇沉淀，基质匹配校准与加权线性回归（1/x²），按FDA/ICH M10验证选择性、线性、准确度、精密度、稳定性、基质效应、提取回收率与流程效率。

3.1 方法的开发与验证：研究人员通过正离子Q1扫描确定ETN101、M1、M2和内标的母离子，优化MRM跃迁；M1在两台仪器定量子离子不同（6495为m/z 227.1→118.0，API 4000为227.1→109.0）。六种色谱柱中仅Poroshell 120 SB-Aq可实现M1/M2基线分离，避免M2源内裂解干扰M1通道。血浆线性2–2,000（ETN101）和0.2–2,000 ng/mL（M1/M2），组织、尿粪各自线性范围均r>0.99；准确度、精密度、短期/冻融/处理后/长期稳定性均达标；ETN101在肝中离子抑制明显、粪中离子增强，但六批间可重复，基质匹配校准保证准确。

3.2 重复口服后药代研究：20 mg/kg连服5天，Day 1和Day 5结果显示ETN101吸收晚、t_1/2约10–13 h；M1暴露远低于母体，M2为优势循环代谢物，C_max和AUC_0–24可接近或超过ETN101；空腹与进食组AUC_0–24、C_max、t_1/2无统计学显著差异，但样本量小仅作探索性结论；Day 5暴露较Day 1数值上略高，但不足以判定蓄积。

3.3 组织分布：第5日24 h取样，ETN101和M2在所有受检组织可定量，M1在脑和脂肪多低于LLOQ；ETN101的K_p以肺、肾最高，M1在脾、肺、肾较高，M2整体K_p较低、大肠最高；空腹/进食无显著影响。

3.4 静脉后尿粪排泄：10 mg/kg静脉给药，尿回收ETN101/M1/M2各≤0.03%，粪回收0.25%/0.76%/2.21%，三者合计约3.3%；说明测得原型与两代谢物并非主要消除形式，未测定氧化/结合代谢物、组织滞留和其他途径可能构成未回收部分。

讨论部分总结：研究人员指出SB-Aq相可避免高水相下传统C18塌陷，M1/M2具芳香核与极性基团需高水相保留；组织将母体（二碱性、亲水）与代谢物（更脂溶）分仪器分析可优化峰形与通量；amlodipine在组织中出现累积基质漂移，故组织换用glipizide作内标。药代上，M2优势暴露依赖NAT1/NAT2，而人类NAT2有多态性，跨种属和人内差异需临床确认。组织K_p为单时间点浓度比而非平衡分配系数。排泄研究用静脉给药避开口服吸收不全干扰，但便中排泄不能区分未吸收药、胆汁分泌和肠分泌；低回收不代表完整质量平衡，大量其他代谢物可解释缺失剂量。

结论部分翻译：本研究开发并验证了简易、灵敏的LC–MS/MS方法，用于大鼠血浆、组织匀浆、尿液和粪便中ETN101、M1和M2的测定。血浆、尿液和粪便用单一assay同步定量三分析物，组织匀浆用两套仪器。口服后ETN101吸收缓慢，M1和M2均见于血浆并与母体药并行下降；ETN101和M2在所有受检组织可定量，M1在脑和脂肪常低于LLOQ；ETN101的K_p以肺和肾最高；静脉后尿回收可忽略，三分析物尿粪合计约3.3%给药量。所述方法可按研究目的选用，适用于ETN101进一步临床前药代与ADME研究。