《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：Combining advanced 3D spheroid-based skin models with deep-learning-based image analysis enables in-depth investigation of keratinocyte differentiation and barrier function
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迄今为止，器官型皮肤模型是临床前皮肤病学和毒理学研究的金标准。然而，其质量存在变异性，且需要较长的成熟时间以及大量细胞，其中主要为原代来源的细胞。研究人员提出将真皮-表皮球状体作为一种兼顾生理相关性与通量的替代模型。与相应的全层皮肤模型（full thickn
迄今为止，器官型皮肤模型是临床前皮肤病学和毒理学研究的金标准。然而，其质量存在变异性，且需要较长的成熟时间以及大量细胞，其中主要为原代来源的细胞。研究人员提出将真皮-表皮球状体作为一种兼顾生理相关性与通量的替代模型。与相应的全层皮肤模型（full thickness skin models, FTSM）并行，研究人员生成了三种不同的成纤维细胞/角质形成细胞共培养球状体。这些研究使用了常用的HaCaT细胞系以及两种近期永生化角质形成细胞系NHK-SV/TERT和NHK-E6/E7。为了以详细的时空分辨率研究其分化过程，研究人员开发并应用了一种基于深度学习分割的分析流程，该流程能够以单细胞精度揭示核形态、核定位以及标志物表达。此外，通过Lucifer Yellow扩散的活细胞成像评估了功能性屏障的形成。基于NHK的共培养球状体展示了功能成熟的强有力证据，包括分层、角化相关特征以及屏障形成，紧密重现了相应全层皮肤模型的特征。此外，NHK-E6/E7细胞被证明是原代角质形成细胞最适合的替代品，而HaCaT细胞在球状体和全层模型中均为最不适合的替代品。鉴于其可扩展性和与自动化技术的兼容性，基于成纤维细胞/NHK的3D共培养微皮肤球状体可能代表一种用于制药、化妆品和毒理学测试的有前景的新型平台。
**论文解读：基于3D球状皮肤模型与深度学习图像分析的角质形成细胞分化及屏障功能研究**
**一、研究背景与问题**
皮肤作为人体最大的器官，是机体与环境之间的动态界面，承担着感觉感知、体温调节以及屏障形成等关键功能，以保护机体免受紫外线照射、脱水以及化学和微生物侵袭。表皮的最外层通过基底层角质形成细胞的增殖及其向顶层的规律性分化、成熟为角质细胞而得以持续更新。每个表皮层均以特异性标志物的表达为特征：细胞角蛋白14（KRT-14）主要表达于基底角质形成细胞，标志增殖层；细胞角蛋白10（KRT10）作为早期分化标志物，丰富表达于棘层下部至颗粒层；外皮蛋白（IVL）表达于棘层上部并在颗粒层中增加；丝聚合蛋白（FLG）局限于颗粒层，参与角质包膜和皮肤屏障的形成。
虽然单层培养的角质形成细胞或成纤维细胞具有培养时间短、成本低的优势，但它们无法重现多层表皮的复杂性及其生理功能。动物实验则存在跨物种差异和伦理问题。因此，各种人源3D皮肤等效模型已被开发并应用于皮肤病学、毒理学和渗透测试的临床前研究。全层皮肤模型（FTSM）是包含真皮层（基质包埋的成纤维细胞）和覆盖其上的角质形成细胞层（成熟为复层表皮）的更高级构造。使用原代角质形成细胞时，重建模型能紧密模拟天然皮肤。然而，原代角质形成细胞存在高度供体依赖性变异、寿命短和可用性有限等缺点。HaCaT细胞系作为常见替代品，分化能力有限且无法形成功能性表皮屏障。为克服这些问题，已有多种永生化角质形成细胞系被建立，且在模拟原代角质形成细胞特征及生成3D表皮或全层皮肤等效物方面表现更佳。然而，体外皮肤模型仍面临制造耗时费力、需要大量细胞以及缺乏稳健自动化流程等挑战，限制了其在高通量筛选中的应用。自组装3D球状体培养作为兼顾生理相关性和通量的折中方案，已在肿瘤研究中得到广泛应用。基于此，研究人员旨在建立一种适用于较高通量的新型全层皮肤3D培养系统，即生成成纤维细胞与不同角质形成细胞系的共培养球状体，并通过定量分析比较其分层、形态和屏障功能与经典体外皮肤模型的差异。
**二、主要技术方法**
本研究采用了以下关键技术方法：1）构建两种皮肤模型体系——基于气液界面（ALI）培养的全层皮肤模型（FTSM）和基于超低附着（ULA）96孔板的自组装共培养球状体模型；2）建立基于深度学习的分割分析流程，使用CellPose（V2.2）对角质形成细胞核进行自动分割，并通过"人在回路"方式为每种细胞系定制训练模型，实现单细胞精度的核形态、核定位和标志物表达定量分析；3）采用共聚焦活细胞成像技术结合灌流系统，对Lucifer Yellow（LY）在球状体中的扩散动态进行实时监测和动力学分析。样本来源方面，成纤维细胞采用人包皮成纤维细胞系CCD-1137Sk（ATCC），角质形成细胞系包括HaCaT（CLS Cell Line Service GmbH）、NHK-SV/TERT（EverCyte GmbH）和NHK-E6/E7（BRAIN Biotech AG）。
**三、研究结果**
**3.1 全层皮肤模型和微皮肤球状体的生成**
在FTSM中，NHK-SV/TERT和NHK-E6/E7细胞系展现出较高程度的分化和分层，具有明显的角质层；而HaCaT FTSM中角质形成细胞排列紊乱，无颗粒层或角化层 appearance。在球状体中，NHK-SV/TERT和NHK-E6/E7球状体在整个观察期内可清晰区分成纤维细胞核心和外部角质形成细胞层，且体积维持或略有增加；而HaCaT球状体体积逐渐减小，提示细胞死亡的发生。NHK-E6/E7球状体展现出更明显的细胞分层结构，第6天时出现致密的外层结构提示角质层形成。
**3.2 NHK-FTSM中细胞分化和分层显著**
免疫荧光分析显示，NHK-SV/TERT和NHK-E6/E7 FTSM中KRT10和IVL定位正确，而HaCaT模型中这两种标志物在整个表皮中重叠表达。NHK模型中紧密连接标志物claudin-1（CLD-1）在中间区域呈现良好的细胞膜定位，而HaCaT中CLD-1染色弥散。深度学习分割的量化分析显示，HaCaT细胞核的偏心率显著低于NHK细胞系，且NHK细胞核长轴与培养表面平行排列，而HaCaT缺乏此定向排列，从定量角度证实了NHK细胞系构建的皮肤模型在分层和分化质量上优于HaCaT。
**3.3 LY实验提示NHK-FTSM中功能性屏障的形成**
Lucifer Yellow（LY）渗透实验显示，LY被保留在NHK-SV/TERT和NHK-E6/E7 FTSM的上层区域，而HaCaT FTSM在冲洗后无LY信号。定量图像分析进一步显示，NHK-SV/TERT FTSM中LY的渗透深度、穿透窗口和总强度均大于NHK-E6/E7 FTSM，这可能反映了两者在角化和颗粒层厚度及结构上的差异。
**3.4 NHK球状体重现表皮分层的重要特征**
定量分析显示，HaCaT球状体的总面积随时间减少，NHK-SV/TERT球状体变大，NHK-E6/E7球状体保持稳定。标志物分析中，CLD-1和FLG仅在NHK-E6/E7球状体中表现出正确的表达和分布，且随培养时间增加而更为明显。KRT10在HaCaT球状体中持续表达但定位异常，而在NHK球状体中呈现正确的区域化分布。NHK-E6/E7球状体在所有时间点均显示IVL和KRT14的最高表达，表明具有明确界定的基底层和分化层。
**3.5 单细胞分析证实NHK球状体的优越分层能力**
基于CellPose深度学习分割的单细胞分析显示，第2天所有球状体表面区域（R1）的细胞核偏心率显著高于其他区域，表明外层细胞呈伸长形态。这种差异在NHK球状体中持续存在，但在HaCaT球状体第2天后消失。核取向分析显示，NHK球状体中R1区域的细胞核与外部边界平行排列，而HaCaT仅在初期有类似现象。在标志物分布上，HaCaT球状体中IVL和KRT10在R1最强；而NHK球状体中KRT10集中于中间区域（R2），与FTSM中的棘上层定位一致，IVL在R1富集并向核心逐渐递减。
**3.6 Lucifer Yellow扩散的活细胞成像提示NHK球状体中功能性屏障的形成**
LY活细胞灌流成像显示，NHK-SV/TERT和NHK-E6/E7球状体在深层（35和70 μm）的LY荧光强度显著低于HaCaT球状体，提示LY能更深地渗透到HaCaT球状体中。径向分析进一步证实，HaCaT球状体核心区域积累了较多LY，而NHK球状体核心区域基本无LY信号，产生显著更高的外/内荧光比值（MIout/MIin）。SDS预处理消除了三种球状体类型之间的差异，证实了NHK球状体中屏障的完整性。
**四、讨论与结论**
本研究表明，由成纤维细胞与NHK-SV/TERT或NHK-E6/E7角质形成细胞组成的共培养球状体能够充分分化成熟为复层表皮结构，与相同细胞构建的FTSM高度相似。相比HaCaT球状体随时间的收缩、解体和成熟障碍，NHK球状体展现出进行性成熟和分层。基于免疫染色切片开发的深度学习分析流程首次实现了对皮肤模型角质形成细胞核形态、位置和标志物表达的单细胞水平系统量化。讨论中排除了光散射效应对深层LY信号减弱的潜在影响，通过三方面论据支持了NHK球状体屏障功能存在的结论。作者指出，NHK细胞单独无法形成球状体，而成纤维细胞核心的存在对实现球状体中的多层层化至关重要。
研究结论为：研究人员开发了由成纤维细胞和永生化角质形成细胞组成的球状体模型，该模型能够成熟为稳健、分层且具有屏障能力的真皮/表皮结构。结合基于深度学习的图像分析工具，这些模型为皮肤病学测试提供了中等复杂度、生理相关且适度高通量的平台。NHK共培养球状体凭借与FTSM匹配的形态学特征和功能特性，兼具可扩展性、自动化兼容性和培养时间短等优势，在药物渗透研究、疾病建模和高通量筛选等领域具有广阔的应用前景，有望补充甚至替代部分传统动物实验和体外皮肤等效模型。
