《Cell Communication and Signaling》：Network integration of neocortical Cajal-Retzius neurons shapes early cortical dynamics and contributes to their transient nature
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Cajal-Retzius神经元（CRN）是哺乳动物新皮层中一类早期产生、具有瞬时性的神经元群体。它们最为人所知的功能是分泌reelin，这对发育中皮层的神经元迁移和分层至关重要。然而，它们向发育中的皮层环路的功能整合及其对早期网络动态的贡献，目前仍了解甚少。
Cajal-Retzius神经元（CRN）是哺乳动物新皮层中一类早期产生、具有瞬时性的神经元群体。它们最为人所知的功能是分泌reelin，这对发育中皮层的神经元迁移和分层至关重要。然而，它们向发育中的皮层环路的功能整合及其对早期网络动态的贡献，目前仍了解甚少。在本研究中，研究人员利用免疫组织化学、GABA能输入的三维重建、细胞外电生理学和钙成像技术，研究了CRN向发育中新皮层网络的结构与功能整合。此外，采用多重荧光原位杂交（multiplexed FISH）测定了不同出生后阶段CRN中氯离子转运体NKCC1和KCC2的表达水平。最后，研究人员采用光遗传学刺激评估CRN激活的功能和发育后果。研究发现，CRN在出生后早期阶段接受致密的树突GABA能突触输入。功能分析显示，相当一部分CRN存在自发放电活动，且其活动与CRN和非CRN神经元均同步。在分子水平上，CRN表现出持续的NKCC1优势表达谱。该表达谱可能促成兴奋性GABA反应，同时也影响其细胞死亡，因为慢性阻断NKCC1在体外与CRN丢失减少相关。在早期阶段急性光遗传学激活CRN可增加器官型新皮层培养物的网络兴奋性，并诱发刺激诱发的场反应，而在后期时间点慢性激活则加速CRN丢失。总之，这些发现表明，在发育过程中，致密的GABA能输入连接与推测的GABA兴奋性作用相结合，可使CRN参与到早期网络活动中。此外，CRN不仅主动参与早期未成熟环路，其活动还放大自发网络动态，并促成其自身的瞬时性，这突显了CRN在新皮层发育中潜在的新型功能作用。
Cajal-Retzius神经元（CRN）是哺乳动物新皮层中一类早期产生、具有瞬时性的神经元群体，以分泌reelin蛋白著称，该蛋白对发育皮层的神经元迁移和分层至关重要。尽管CRN已被研究逾一个世纪，但它们如何整合进发育中的皮层环路、对早期网络动态有何贡献，仍缺乏系统认识。研究人员在《Cell Communication and Signaling》发表研究，围绕CRN的输入连接、自发活动、氯离子转运体表达及激活后果展开探索。
在方法上，研究人员以ΔNp73Cre/Ai14小鼠标记CRN，并结合Bax条件敲除（BaxCKO）保留成年CRN亚群；利用免疫组织化学和三维重建定量CRN树突上的vGAT阳性GABA能（GABAergic）突触输入；在器官型新皮层培养物（organotypic neocortical cultures, OTCs）中联合表达Cre依赖的红色钙指示剂jRCaMP1b和广谱绿色钙指示剂GCaMP6s进行双色钙成像；对急性脑片进行多电极阵列（multi-electrode array, MEA）记录及c-Fos免疫染色；采用多重荧光原位杂交（multiplexed FISH）检测NKCC1和KCC2的mRNA水平；并通过AAV介导的Cre依赖ChR2(H134R)-EYFP进行急性和慢性光遗传刺激。样本来自出生后不同日龄（P0至成年）的小鼠，OTCs取自P0-3小鼠。
结果部分总结如下：
**新皮层CRN在消失前接受高密度GABA能输入**
研究人员在P3、P8、P17及成年BaxCKO小鼠中纵向定量CRN的树突vGAT密度。结果显示，CRN密度随年龄显著下降；CRN树突vGAT密度在P3和P8时保持较高水平且相近，至P17显著降低，成年存留CRN的vGAT密度与P17相当。相比之下，上层皮层整体vGAT密度随年龄增加。这表明CRN在早期是GABA能突触的主要靶点，而在其消失前输入减少。
**CRN在早期发育中自发活跃并功能整合进皮层网络**
OTCs双色钙成像显示，约40%的CRN在DIV7/8具有自发钙活动；CRN-CRN以及CRN-非CRN对的共活动重叠指数（Jaccard index）相近，且95%的CRN活动时间与网络事件重合。急性脑片c-Fos染色显示约30%的CRN在对照条件下为c-Fos阳性；用4-氨基吡啶（4-AP）增强网络兴奋性后，c-Fos阳性CRN比例轻度升高至约39%。这些结果表明CRN活动与网络动态高度同步，且增强网络兴奋性倾向于激活CRN。
**CRN终生维持NKCC1高于KCC2的mRNA表达，这有助于CRN细胞死亡**
多重FISH显示，皮层LII/III神经元在P3至P8间从NKCC1优势转变为KCC2优势表达，而CRN在P3、P8、P17及成年BaxCKO存留CRN中始终维持NKCC1高于KCC2的表达比例。在OTCs中慢性应用NKCC1抑制剂布美他尼（bumetanide）后，ΔNp73阳性CRN的密度有升高趋势（实验组p=0.06），提示NKCC1相关氯离子内流可能促进CRN死亡。
**CRN刺激放大早期新皮层网络动态，并在后期加速CRN丢失**
在DIV7/8的OTCs中，急性光遗传激活CRN（3ms或10ms蓝光脉冲，20Hz）可诱发即时的场反应，且10ms脉冲诱发的反应更可靠；重复3ms脉冲刺激使刺激间期的自发网络事件率增加至基线的约180%，事件幅度和涉及电极数显著增加，而对照组无此效应。在DIV9/10至DIV15/16进行慢性光遗传刺激6天，受刺激的CRN-ChR2培养物中CRN密度显著低于未刺激或未表达ChR2的对照组，说明持续CRN激活加速其消亡。
讨论与结论方面，CRN从出生即接受致密GABA能输入，且其氯离子转运体表达谱使GABA可能呈兴奋性作用，这使得CRN能被网络活动招募而非抑制。CRN活动与早期间歇性网络振荡高度同步，并可通过其输出影响网络兴奋性，提示一个自我放大的CRN-网络环路。在发育后期，这种兴奋性活动经NKCC1相关机制促进CRN死亡。异常CRN存活或过早丢失与多种皮层病理有关，因此CRN活动依赖性消失具有临床意义。总之，该研究揭示了CRN在整个生命周期中的特征，阐明了其功能整合入未成熟新皮层环路的新方面；推测的兴奋性GABA能驱动和功能整合最终促进CRN的瞬时性；CRN活动不仅与早期网络活动相关，还能影响网络活动，形成自我放大环路，在早期提高皮层活动水平，并在后期导致CRN的自然丢失。
