一种伪批量通路活性评分方法的多准则基准测试揭示排名窗口截断是单细胞 RNA 测序中生物信号丢失的一种双向机制

《BMC Bioinformatics》：PathwayBench: a multi-criterion benchmark of pseudobulk pathway activity scoring methods reveals rank-window truncation as a two-sided mechanism of biological signal loss in single-cell RNA-seq

　　

摘要

背景

通路活性评分是单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析中广泛使用的一个步骤，然而在其应用之处，方法选择很少在伪批量病例-对照体系中受到系统的、多标准证据的指导，而该体系目前主导着应用于单细胞疾病研究。先前的单细胞通路评分基准测试聚焦于细胞级别分辨率下的扰动真值，使得供体级别的伪批量设定——以及为何各方法产生分歧这一问题——基本未被触及。

结果

我们提出了PathwayBench，一个基准测试，在八个涵盖五种组织（脑、心脏、肾脏、肺、血液）和682名供体的伪批量scRNA-seq病例-对照数据集上，比较了五种广泛使用的通路评分方法（ssGSEA、GSVA、z-score、AUCell、UCell）。方法依据五项标准进行评估，涵盖生物学相关性（方向准确性、AUROC、效应量）和四个鲁棒性维度（聚合、异常值、归一化、样本量稳定性）。我们识别出排名窗口截断作为顶部窗口排名方法（AUCell、UCell）丧失生物学信号的双向机制：当通路基因落在固定顶部排名窗口之外时，它们变得"盲目"；当非通路竞争基因入侵该窗口时，它们被削弱或反转。49条件模拟扫描显示该效应在整个参数网格上广泛存在：当通路基因落在AUCell默认窗口以下时，AUCell在49个条件中的33个返回零值评分，且在竞争基因负担较重时两种排名方法均出现符号反转。在真实数据上的窗口参数实验表明，放宽排名窗口在中间设置下恢复了大部分丧失的信号，证实默认的单细胞窗口对于密集的伪批量谱系是不正确的设置。真实数据示例来自慢性肾脏病中的细胞外基质（ECM）重塑，其中顶部窗口排名方法在三种归一化方法下产生接近零或错误方向的效应。将各标准下的表现离散化为良好/中等/较差表明，在主阈值下没有任何单一方法满足全部五项标准。由于该分类对阈值和权重选择敏感，我们报告底层的连续评分作为主要证据，仅将离散记分板作为汇总辅助工具。

结论

排名窗口截断为全分布方法与顶部窗口截断排名方法在scRNA-seq数据上的系统性分歧提供了机制解释。我们采用三族分类法——跨样本标准化幅度（z-score）、排名-富集混合方法（ssGSEA、GSVA）和顶部窗口截断排名方法（AUCell、UCell）——该方法比幅度对排名的二分法更准确，因为ssGSEA本身就是基于排名的富集统计量。该分类法应指导方法选择，特别是针对纤维化、炎症或其他广泛重塑的转录组。PathwayBench以版本化、可扩展的基准测试形式交付，包含每个数据集的评分、一个交互式咨询应用程序以及完整的可重复性基础设施，以支持基于证据的方法选择和社区扩展。