《Probiotics and Antimicrobial Proteins》：Harnessing Probiotic LAB and Bacteriocins for Clean-Label Food Processing and Biopreservation: Omics, Molecular Innovations and Industrial Applications
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微生物因子在食品中的持续存在，尤其是产芽孢细菌，是食品保鲜与安全面临的最重大挑战之一，其损害了产品质量、货架期及消费者健康。传统控制方法（包括热处理和化学防腐剂）的应用日益受到消费者对最低限度加工食品需求的限制，以及耐药性微生物菌株的出现。在利用益生菌（如乳酸
微生物因子在食品中的持续存在，尤其是产芽孢细菌，是食品保鲜与安全面临的最重大挑战之一，其损害了产品质量、货架期及消费者健康。传统控制方法（包括热处理和化学防腐剂）的应用日益受到消费者对最低限度加工食品需求的限制，以及耐药性微生物菌株的出现。在利用益生菌（如乳酸菌（LAB））及其生物代谢产物（如细菌素）进行食品加工与保鲜方面已取得进展，特别是在控制生物被膜和内生芽孢形成病原菌方面，包括食品及食品加工厂/表面中的芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、李斯特菌属（Listeria sp.）、葡萄球菌属（Staphylococcus sp.）、梭菌属（Clostridium sp.）、大肠杆菌（E. coli）等。鉴于这些微生物引起食源性疾病的能力、在食品加工生态系统中形成顽固生物被膜的能力及其对常规消除方法的抗性，抗菌肽（细菌素）作为合成抗菌剂的有效替代品，在提升食品安全和应对这些病原菌威胁方面日益受到重视。本综述探讨了利用乳酸菌及其细菌素抑制食品工业关注的持续性微生物腐败污染物、生物被膜形成病原菌及芽孢形成菌的最新信息。本文还探讨了细菌素分离、表征及作用机制方面的最新进展，包括与其他保鲜栅栏技术（如包封和纳米生物技术）的协同作用。重要的是，本文聚焦于利用分子和组学方法，以更好地理解细菌素生物合成、基因调控、宿主-微生物互作及益生乳酸菌的肠道微生物组调节潜力，从而促进靶向性和菌株特异性干预措施的合理开发。本文还讨论了产细菌素乳酸菌在功能性发酵剂培养物和生物保护产品中的应用进展，以及其在稳定性、法规审批和工业规模化方面的挑战。尽管潜力巨大，但更广泛的转化仍受限于法规要求、生产和制剂成本、复杂食品基质中功效的变异性，以及许多候选细菌素在实验室和模型食品系统之外的有限验证。总体而言，这些进展使乳酸菌及其细菌素处于开发可持续、清洁标签且高效的功能性食品和食品保鲜系统的最前沿。通过整合基因组学、合成生物学和预测建模，可进一步扩展其功能，以在不同食品基质和肠道微生物群调节中最大化其生物保鲜潜力。
定义与“清洁标签”食品的演变
“清洁标签”一词没有统一的法规定义，但在实践中，它指的是以简短、可识别的配料表、最低限度加工以及排除（或减少）消费者认为不理想的合成添加剂（如人工色素、香料和某些化学防腐剂）为特征的食品。从历史上看，清洁标签运动源于消费者对工业化食品加工日益增长的不信任，其催化剂是周期性的食品安全危机和丑闻。其中值得注意的是20世纪80年代和90年代的牛海绵状脑病（BSE）或“疯牛病”疫情，后来人们将BSE与人类克雅氏病（Creutzfeldt–Jakob disease）联系起来，这是在食用受朊病毒污染的牛肉或牛肉制品多年之后。这场危机引发了人们对与受污染食品相关的不可预见、长期危险的担忧，导致不信任情绪蔓延，并显著改变了人们的食品消费方式。同样，1999年比利时二噁英污染鸡肉事件中，二噁英和多氯联苯（PCBs）通过动物饲料进入食物链，也加剧了公众对隐形污染物和食品行业危机管理不善的担忧。这些危机虽然实际健康影响有限，但产生了长期的心理和经济影响，导致消费者对加工食品的信心下降。因此，消费者的态度开始围绕纯净、透明和可追溯性的价值观趋同，不仅要求了解营养成分信息，还要求了解道德采购和生产方法。因此，清洁标签运动可以被视为早期“纯净食品”和“天然食品”趋势的延伸，反映了消费者对安全、质量和控制的深层渴望。清洁标签产品强调熟悉的配料以及采购和加工的透明度，其营销通常基于信任和感知的健康益处，而非正式的营养声明。在过去二十年中，这种由消费者驱动的清洁标签理念已从营销利基演变为全球食品制造商的主要产品开发优先事项。它也开辟了一个关键的科学和工业机遇：用生物来源的替代品替代合成添加剂，以确保货架期和微生物安全。在这方面，乳酸菌（LAB）及其细菌素已成为实现清洁标签合规的有前景工具。作为广泛用于发酵和食品保鲜的天然微生物，乳酸菌符合消费者和监管机构对安全性、功能性和天然性的期望。其代谢产物，尤其是细菌素，显示出与合成防腐剂相当的抗菌功效，但其来源于符合清洁标签运动核心生态价值的过程。通过组学技术和分子创新对这些生物保鲜剂的日益科学验证，使其处于新一代清洁标签食品加工系统的最前沿。
益生乳酸菌（LAB）：多样性、功能性与食品应用
主要益生乳酸菌属概述
益生菌是“当摄入足够量时，能对宿主产生健康益处的活微生物”。益生乳酸菌可从多种来源分离，包括人类、动物和发酵食品。益生菌菌株若要被认为适合人类食用，必须从人类微生物区系系统中分离，并对人类肠道细胞壁具有高度粘附性。此外，该菌株需要是安全的，不危害宿主。属于乳杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的益生菌是最常用的类型；这些细菌的多种菌株已显示出显著的体外和体内特性。乳酸菌是人体健康益生菌用途中研究最多的微生物，其中大多数被认为是GRAS（公认安全）微生物。益生菌穿透人体消化系统，附着于肠道上皮细胞，并表现出多种有利的生物学功能，如与上皮层的竞争性粘附、合成抑制病原菌的微小抗微生物分子和肽、刺激不同的免疫调节细胞因子以维持促炎和抗炎细胞因子的平衡，以及合成细菌素。细菌素由多种细菌产生，其中乳酸菌是研究最广泛的。乳酸菌属于多个系统发育类群，其中大多数为革兰氏阳性菌，但它们都具有相似的特征。乳酸菌通常以葡萄糖为主要分解代谢终产物合成乳酸为特征。它们通常从营养丰富的环境中分离，如牛奶、肉类、蔬菜、水果和乳制品等发酵食品和饮料，这些环境具有低氧张力、可溶性碳水化合物以及现成的维生素和蛋白质。它们也常见于粪便、废水和哺乳动物肠道粘膜中。根据物种不同，乳酸菌生长的最适pH范围在5.5至6.5之间，最适生长温度为20至45°C。大多数乳酸菌是兼性厌氧菌，不运动、不产芽孢。根据发酵终产物，产乳酸细菌分为同型发酵和异型发酵两类。同型发酵乳酸菌将葡萄糖转化为乳酸（主要副产物），而异型发酵乳酸菌（可以是兼性型或专性型）将葡萄糖转化为乳酸、乙醇或乙酸以及二氧化碳。除乳杆菌属外，其他乳酸菌属也表现出独特的益生特性和食品加工中的技术功能性。例如，乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）是工业上开发最多的乳酸菌物种之一，因为它在一些乳制品（包括发酵黄油、奶酪和其他发酵产品）的生产中起着关键作用。值得注意的是，它通过产酸和产生抗微生物代谢物（如乳链菌肽（nisin），一种已被FDA和EFSA批准为天然食品防腐剂的充分表征的细菌素）来帮助发酵食品的风味、质地和安全性发展。片球菌属（Pediococcus）成员，包括乳酸片球菌（P. acidilactici）和戊糖片球菌（P. pentosaceus），广泛用于肉类、蔬菜和谷物发酵。这些物种表现出对低pH和高盐浓度的耐受性，并已知产生片球菌素（pediocin），一种对单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和其他革兰氏阳性病原菌有效的强效细菌素。明串珠菌属（Leuconostoc）的异型发酵物种，如肠膜明串珠菌（L. mesenteroides）和泡菜明串珠菌（L. kimchii），在蔬菜和乳制品发酵中起着至关重要的作用。它们通过转化葡萄糖分子，促进风味发展和乙醇、乳酸及二氧化碳的产生，增强发酵蔬菜和黄油的质地。它们产生的胞外多糖（EPS）不仅支持食品中的清洁标签质构化，还具有相当大的商业潜力。尽管肠球菌属（Enterococcus）物种，主要是粪肠球菌（E. faecium）和屎肠球菌（E. faecalis），因其潜在的抗生素耐药性而存在争议，但选定的菌株已显示出强大的益生功效，包括肠道定植、病原菌抑制和宿主免疫调节。由于它们易于获得各种毒力因子和对多种抗生素的耐药性，必须经过受控选择和基因组筛选，才能被认为可安全用于食品应用。总的来说，这些属展示了乳酸菌作为实现全球食品工业清洁标签转型的不可或缺的微生物工具的生态、功能和技术多样性。有机酸、细菌素和胞外多糖的产生有助于在不使用合成防腐剂的情况下，自然改善食品安全、感官品质和货架期。
益生菌功能性机制
竞争性排斥
竞争性排斥已被报道为乳酸菌通过竞争肠道上皮细胞上的粘附位点和必需营养素来减轻病原菌定植的有效机制。某些双歧杆菌菌株已被证明通过占据病原菌通常靶向的上皮结合位点来预防胃肠道感染，从而减少病原菌附着和增殖的机会。其他乳酸菌物种也观察到类似的粘膜粘附和对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica）和大肠杆菌（Escherichia coli）等病原菌的竞争性抑制。竞争性排斥是益生菌的核心功能，与肠道健康和清洁标签食品保鲜策略都相关，乳酸菌菌株可以在不使用合成添加剂的情况下自然抑制腐败和致病微生物。
免疫调节
益生乳酸菌可以与肠道上皮细胞和肠道相关免疫细胞（如单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞）相互作用，调节宿主免疫反应，改善肠道屏障功能和整体健康。这种相互作用的一个关键方面涉及益生菌细胞表面分子被模式识别受体（尤其是这些免疫细胞上表达的Toll样受体（TLRs））识别。TLR介导的信号传导激活触发下游通路，如核因子-κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs），这些通路调节参与维持免疫平衡的细胞因子和趋化因子的受控释放。通过这种机制，益生菌可以调节促炎和抗炎反应，促进免疫稳态。此外，口服各种益生菌已被报道通过IL-6介导的信号通路诱导B细胞扩增，刺激分泌型IgA的产生。这导致粘膜免疫的加强，而不干扰CD4+ T细胞的平衡。这些调节活性强调了乳酸菌在清洁标签食品系统中的相关性，其中天然嵌入的免疫支持特性提供了功能性营养价值。
代谢产物产生
除了竞争性排斥和免疫学作用外，乳酸菌已被认识到能产生多种生物活性代谢物，如有机酸（例如乳酸、甲酸、丁酸、乙酸和丙酸）、过氧化氢、双乙酰、胞外多糖、溶菌酶和细菌素。其中一些物质具有抑菌或杀菌作用，可以单独或组合作用，抑制食品中腐败和致病微生物的生长。
肠道微生物组调节与宿主-微生物互作
除了其在食品保鲜中的既定作用外，益生乳酸菌在食用后还可以与常驻肠道微生物群和肠道宿主相互作用，为其功能价值提供了第二个维度。在胃肠道中，乳酸菌可以瞬时与粘膜表面相互作用，与病原菌竞争营养和粘附位点，并通过碳水化合物发酵和有机酸及其他生物活性代谢物的产生来改变局部代谢环境。它们的影响还可以通过交叉喂养间接扩展到微生物群的其他成员，乳酸菌衍生的代谢物（如乳酸和乙酸盐）可作为其他共生菌（包括参与短链脂肪酸产生的生物体）的底物。来自动物模型的证据表明，细菌素的产生可以影响肠道微生物组成，尽管这些影响通常是菌株和背景依赖性的。这些发现支持细菌素原性乳酸菌可能通过其直接抗菌活性之外的方式影响肠道微生物群落的概念，尽管这些变化的大小、持久性和健康意义仍未被充分表征。因此，肠道微生物组调节代表了乳酸菌和细菌素功能的一个重要但相对欠发达的维度。整合微生物组分析、代谢组学、转录组学和细菌素表征，有助于阐明个体乳酸菌菌株如何与常驻微生物群落相互作用，以及这些相互作用是否能转化为可重复的健康益处。
细菌素：来自乳酸菌的天然抗微生物剂
细菌素是由细菌（特别是乳酸菌（LAB））核糖体合成的抗微生物肽，可抑制密切相关物种（窄谱）甚至系统发育上遥远的一大类微生物（广谱）的生长。其天然来源、特异性和对食品腐败菌及病原菌的功效，使其成为发酵食品和其他食品系统中的重要生物保鲜剂。乳酸菌是研究最多的细菌素来源，因为它们具有GRAS和QPS地位以及在发酵食品中的悠久历史。据报道，产生细菌素的常见乳酸菌属包括乳球菌属（Lactococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）（目前为Lacticaseibacillus和Lactiplantibacillus）、片球菌属（Pediococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、链球菌属（Streptococcus）、魏斯氏菌属（Weissella）和明串珠菌属（Leuconostoc）。这些生物体可以组成型地或响应环境信号（涉及营养限制、细胞密度或应激）产生细菌素。重要的是，产生通常发生在指数生长后期或稳定期早期，这与发酵食品中常见的情况（如低pH、盐应激或高细胞密度）相吻合。这表明细菌素不仅有助于发酵食品的微生物稳定性和安全性，也有助于乳酸菌在复杂微生物环境中的生态竞争力。
细菌素的作用机制
不同的细菌素有不同的作用模式。有些是抑菌的，表明它们能够抑制细胞生长，而另一些是杀菌的，表明它们能够诱导细胞裂解或产生杀菌效果。例如，I类阳离子羊毛硫抗生素通过与靶细胞壁和肽聚糖上脂质II（lipid II）的前体成分相互作用，产生细菌素和脂质II的复合物。然后该复合物与靶细菌的细胞膜结合，形成允许Mg2+和Ca<2+>离子逸出的孔洞。大多数源自乳酸菌的细菌素，尤其是那些抑制革兰氏阳性菌的，通过特异性靶向与细胞膜相关的机制来对抗细菌。它们干扰DNA、RNA和蛋白质的代谢，从而导致靶细胞死亡。这主要通过抑制DNA旋转酶介导的DNA超螺旋来实现，从而阻止DNA复制。几种羊毛硫抗生素和一些II类细菌素靶向脂质II并抑制肽聚糖的合成。在其他情况下，脂质II也可以被其他细菌素用作对接分子，以促进细胞膜上孔洞的形成，最终导致膜电位丧失和细胞死亡。许多乳酸菌细菌素的一个主要局限性是它们的谱相对较窄，特别是对革兰氏阴性食源性病原菌的活性较差。沙门氏菌（Salmonella）和大肠杆菌等生物的外膜和脂多糖层限制了许多细菌素进入其细胞质膜或脂质II靶标。因此，已经探索了几种补充策略来克服这一障碍。最成熟的方法之一是使用膜透化剂，特别是EDTA，它螯合稳定外膜的二价阳离子。物理处理可以提供类似的效果：高静水压（HHP）处理增强了乳链菌肽介导的沙门氏菌灭活。第二种策略是分子工程来改变细菌素的靶向性或活性。递送技术提供了进一步提高细菌素性能的途径。总的来说，这些发现表明，将细菌素活性扩展到革兰氏阴性食源性病原菌不太可能依赖于单一解决方案；相反，外膜透化、栅栏处理、理性肽工程、病原菌靶向递送和受控包封可以结合起来，克服限制天然细菌素渗透性和稳定性的屏障。
细菌素相对于合成防腐剂的优势
细菌素相对于传统合成防腐剂有几个优势，使其成为清洁标签食品保鲜中最有前景的候选物之一。作为核糖体合成的肽，细菌素通常被认为是GRAS、无毒的，并且容易被胃肠道蛋白酶消化，减少了生物累积或慢性毒性的任何潜在担忧。与可能引起过敏反应甚至致癌风险的合成化合物（如亚硝酸盐、苯甲酸盐和山梨酸盐）不同，细菌素不会在食品系统中引入化学残留物，这与监管和消费者对最低限度加工和天然保鲜的期望高度一致。细菌素的另一个主要优势是其高特异性。虽然广谱化学防腐剂不加选择地抑制腐败生物和有益微生物群，但细菌素通常具有窄或可控的抗微生物谱，靶向特定的腐败和致病物种。这使得细菌素能够在不干扰理想的发酵或益生乳酸菌种群的情况下发挥作用，从而保护发酵食品的感官品质、发酵性能和微生物组平衡。另一个重要益处是在不同加工条件下的功能稳定性。许多细菌素在变化的pH、高盐浓度和/或中等热处理下保持抗微生物活性，允许其在奶酪成熟、肉类腌制、即食食品和发酵蔬菜系统中有效使用。此外，产细菌素乳酸菌菌株可以作为发酵剂、辅助剂或保护性培养物原位应用，允许在发酵或储存期间提供连续的抗微生物活性，而无需加工后添加步骤。安全性、靶向抗微生物作用和工艺稳健性的结合，使细菌素特别适合现代食品系统，平衡消费者对天然成分的需求与行业对微生物稳定性和产品质量的需求。
细菌素对抗生物被膜形成和内生芽孢形成病原菌：机制与最新进展
生物被膜形成和内生芽孢形成使重要的食源性病原菌，包括单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和梭菌属（Clostridium spp.），能够在环境和加工应激下持续存在。生物被膜在食品加工环境中尤其成问题，因为细胞外聚合物（EPS）基质和固着细胞的生理改变会降低对常规抗微生物处理的敏感性。因此，乳酸菌产生的细菌素代表了一种有前景的补充策略，用于防止生物被膜建立和控制已建立的种群，尽管其有效性强烈依赖于细菌素、靶菌株、生物被膜成熟度、表面和食品基质。
生物被膜抑制机制
乳酸菌及其细菌素可以在几个阶段干扰生物被膜的发育，包括初始粘附、微菌落形成、成熟和持续存在。在附着阶段，细菌素和乳酸菌衍生的代谢物可以改变细菌表面特性，减少对食品接触材料的粘附。一旦生物被膜建立，细菌素可以通过与浮游种群中观察到的类似机制靶向代谢活跃的固着细胞，包括膜透化、孔形成、质子动势消散、细胞质渗漏和干扰细胞壁生物合成。越来越多的证据还表明，抗生物被膜活性涉及更广泛的调控效应。然而，对已建立生物被膜的活性比对初始形成的抑制更具挑战性。EPS基质会限制细菌素的扩散，而营养梯度和生理异质性会产生代谢活性降低和耐受性增加亚群。因此，细菌素对成熟生物被膜的活性不能必然地从浮游MIC值预测。事实上，对乳酸菌细菌素对抗食源性病原菌的研究通常报告对生物被膜形成或早期生物被膜有更强的作用，而不是完全根除成熟生物被膜。这一区别在考虑将细菌素用于食品加工环境的卫生和生物被膜控制时非常重要。
抗生物被膜细菌素
乳链菌肽仍然是控制食源性生物被膜的最充分表征的乳酸菌细菌素。其他乳酸菌细菌素也表现出对单核细胞增生李斯特菌生物被膜的活性，尽管抑制程度随肽和实验系统而变化。这些发现表明，抗生物被膜活性超出了经典的乳链菌肽-李斯特菌模型，尽管菌株特异性和对成熟生物被膜的不完全根除仍然是重要的局限性。
内生芽孢形成病原菌的控制
控制内生芽孢形成病原菌（如芽孢杆菌属和梭菌属）需要不同的策略，因为休眠内生芽孢对抗微生物肽的抵抗力远高于营养细胞。它们在食品系统中的重要性不仅在于加工过程中的存活；萌发和随后的出芽可以恢复能够引起腐败以及（在产毒物种中）食源性疾病的代谢活跃种群。因此，对于细菌素，实际目标通常不是直接根除休眠芽孢，而是抑制萌发、出芽和随后的营养生长。乳链菌肽提供了对抗内生芽孢形成病原菌的细菌素的最佳表征例子之一。然而，其活性在肉类模型中显著降低，强调了抗出芽活性与真正杀芽孢活性之间的区别，以及食品基质条件对功效的影响。
