烷烃氧化菌群产生大量二糖

《Frontiers in Microbiology》：Alkane-oxidizing consortia produce substantial amounts of disaccharides

　　

摘要翻译：

由古菌与伴生细菌组成的菌群将烷烃的厌氧氧化与硫酸盐还原耦合。尽管厌氧烷烃氧化古菌(ANKA)的分解代谢途径已被广泛研究，但其合成代谢能力仍知之甚少。本研究利用溶剂萃取及衍生化提取物的气相色谱分析，检测了以ANKA及其伴生细菌为主的九个富集培养物中的小分子化合物。所有烷烃降解培养物的代谢物库中均含有大量二糖。以ANME-2c和Seep-SRB2为主的冷适应甲烷氧化培养物中，海藻糖含量高达每毫克可溶性蛋白1.5 mg。在Candidatus Ethanoperedens及其独特伴生SRB的乙烷氧化培养物中，海藻糖同样丰富，占提取代谢物的高达75%。相比之下，以ANME-1或Candidatus Syntropharchaeum和Candidatus Desulfofervidus为主的热适应性ANKA培养物中，含有大量迄今未鉴定的含己糖二糖。宏基因组分析显示，海藻糖代谢基因在伴生脱硫菌门(Desulfobacterota)以及ANME-2c和Ca. Ethanoperedens中广泛存在，但在ANME-1和Ca. Syntropharchaeum中潜力较低，这与代谢物谱一致。当向热适应性乙烷氧化富集物中添加外源海藻糖时，研究人员观察到异养微生物快速代谢海藻糖，但Ca. Ethanoperedens/Ca. Desulfofervidus核心菌群对其同化较差，表明ANKA/SRB菌群不消耗外源供给的海藻糖。相反，Ca. Ethanoperedens/Ca. Desulfofervidus以及其他ANKA/SRB菌群可能利用二糖作为能量储存分子、渗透调节物质或胞外基质组分。菌群产生的二糖还可维持附属异养微生物的生长，从而将烷烃氧化与更广泛的沉积物碳循环联系起来。

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一、研究背景与科学问题

在深海沉积物中，产甲烷古菌产生大量甲烷，同时热成因的生物质降解以及氢与二氧化碳的非生物反应也会生成甲烷及其他烷烃。这些化合物是厌氧烷烃氧化古菌(ANKA)的能量底物，其中多数ANKA与硫酸盐还原细菌在硫酸盐-甲烷界面形成共养共生关系。厌氧甲烷氧化古菌(ANME)通过厌氧甲烷氧化(AOM)消耗海洋沉积物中高达90%的甲烷（每年约380 Tg），在缓解甲烷排放中发挥关键作用。ANKA还包括氧化乙烷、丙烷和丁烷等短链至长链烷烃的古菌，如Candidatus Ethanoperedens和Candidatus Syntropharchaeum等。

尽管ANKA通过逆产甲烷途径或变异甲基辅酶M还原酶激活烷烃底物并实现完全氧化，其分解代谢机制已被阐明，但关于这些古菌的合成代谢能力，尤其是碳水化合物代谢潜力，仍存在显著认知空白。已有研究指出，在若干代谢模型中，乙烷氧化古菌可能无法产生足够低氧化还原电位的电子载体来支持合成代谢的CO₂固定。此外，关于ANKA及其伴生硫酸盐还原菌(SRB)之间电子传递和碳代谢的研究多聚焦于分解代谢途径，而二糖等碳水化合物的代谢作用尚未被探索。因此，研究人员系统研究了厌氧烷烃氧化菌群是否具备产生和代谢二糖的能力，重点关注其合成代谢途径和代谢多功能性。

二、研究内容与技术方法

研究人员分析了来自不同地理来源（包括喀斯喀迪亚边缘、意大利厄尔巴岛、ISIS泥火山及瓜伊马斯盆地等）的九个无沉积物富集培养物，涵盖甲烷、乙烷、丙烷和丁烷氧化体系，培养温度范围为12至50°C。代谢物分析采用溶剂萃取结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术，对衍生化提取物中的极性小分子代谢物进行定性和定量检测。宏基因组分析利用GTDB(R220)数据库中的ANKA和伴生SRB基因组，通过隐马尔可夫模型(HMM)搜索注释海藻糖、蔗糖及多糖代谢相关蛋白家族。对关键酶（OtsA、TreP/MalP、TreT）构建基于氨基酸序列的系统发育树以探究水平基因转移(HGT)事件。稳定同位素探针实验通过添加¹³C标记的海藻糖和¹³C-碳酸氢盐(DIC)至乙烷氧化富集物E50中，追踪标记碳向各微生物类群特征脂质（古菌类异戊二烯烃和细菌脂肪酸）的流动。

三、主要研究结果

3.1 烷烃氧化富集培养物中含大量二糖

GC-MS分析显示，除ANME-2a/2b/2c主导的ISIS20培养物外，所有富集培养物的BSTFA衍生化二糖占已注释代谢物谱的50%以上。冷适应的HR12培养物中主要二糖鉴定为海藻糖，含量高达每毫克可溶性蛋白1.5-2 mg。相比之下，ANME-1主导的GB50培养物每毫克可溶性蛋白仅含0.2 mg海藻糖，代谢物提取物中主要是一种在21.7分钟洗脱的未鉴定含己糖二糖。丙烷和丁烷氧化培养物中有类似的未知化合物（22.4分钟洗脱），虽然NIST谱库将其注释为4-O-β-半乳糖吡喃糖基-D-甘露糖吡喃糖(GPMG)，但与真实标准品在保留时间和质谱碎片（m/z 351）上存在差异，提示这些是尚未鉴定的新型二糖异构体。低温AOM培养物（Elba 20、HR12、GB37）均含海藻糖；50°C乙烷氧化培养物E50同时含海藻糖和未知二糖；室温乙烷氧化培养物E20几乎只含海藻糖；ISIS20培养物则以蔗糖为主。

3.2 部分ANKA及伴生SRB编码互补的二糖代谢基因

宏基因组HMM搜索显示，Ca. Ethanoperedens具有最高的二糖代谢潜力（平均每基因组6.1个HMM命中），ANME-2c也编码多种关键酶，包括海藻糖合酶(TreT)、海藻糖-麦芽糖磷酸化酶(TreP/MalP)和海藻糖-6-磷酸合酶(OtsA)。其他ANME类群（ANME-2a/2b、ANME-2d、ANME-1）及Ca. Syntropharchaeales和Ca. Methanoliparaceae的平均命中数较低。所有ANKA中均缺乏催化海藻糖不可逆降解的酶变体。伴生SRB进化枝的二糖代谢谱更广泛多样，λ值从Seep-SRB1d的5.5到Seep-SRB2的8.1，部分SRB含不可逆海藻糖酶TreH和TreA的HMM命中。

3.3 ANKA与伴生细菌通过水平基因转移共享海藻糖代谢

系统发育分析揭示了多个跨结构域HGT事件。TreP/MalP序列的系统发育显示，ANME-2c与Ca. Ethanoperedens的一个成员形成独立进化枝，表明这两个ANKA谱系之间存在HGT；Ca. Ethanoperedens thermophilum的TreP/MalP与Syntrophotalea共享祖先，而Ca. Ethanoperedens ethanivorans的该蛋白与Seep-SRB2共享祖先。OtsA树显示ANME-1形成独特的古菌进化枝，而Ca. Syntropharchaeales中两个OtsA同源基因嵌套在细菌进化枝内，其最近同源物来自Ca. Desulfofervidia，是明确的HGT案例。Ca. Ethanoperedens的otsA可能从与Desulfuromonadia的共同祖先获得。TreT树中，Desulfofervidia的一个进化枝与氢营养型产甲烷菌Methanoculleus共享根部，另一个进化枝则与Ca. Ethanoperedens共享祖先。

3.4 稳定同位素探针揭示海藻糖消耗型侧翼微生物群落活性

在E50乙烷氧化富集培养物中进行的¹³C-海藻糖标记实验显示，异养生物相关的异构支链脂肪酸iC15:0、iC16:0和iC17:0在数小时内δ¹³C值即超过1000‰，7天内超过3000‰，表明异养微生物快速消耗海藻糖。SRB相关的直链脂肪酸C16:0和C18:0的标记掺入较低（δ¹³C-C16:0 < 400‰，δ¹³C-C18:0 < 30‰）。Ca. Ethanoperedens的古菌标志物植烷(phytane)和联植烷(biphytane)仅表现微弱的标记掺入，且不依赖乙烷供给，低于向DIC库转移量的一个数量级。在¹³C-DIC标记实验中，Ca. Ethanoperedens的类异戊二烯脂质对DIC的同化依赖乙烷供给，伴生SRB的脂肪酸对DIC同化也依赖乙烷，但异养生物相关的支链脂肪酸显示较强的DIC来源¹³C掺入。

四、讨论与结论

讨论部分指出，冷适应甲烷氧化培养物中每毫克可溶性蛋白1.5-2 mg的海藻糖含量几乎是以往报道的嗜盐古菌Haladaptatus paucihalophilus在极端渗透胁迫下最高水平的两倍，但仍在嗜盐SRB盐胁迫响应的最高范围内。关于二糖产生来源，虽然缺乏直接证据，但比较共享相同伴生细菌而优势糖不同的热适应性富集物后发现，E50培养物中古菌具有海藻糖代谢能力时海藻糖为主要二糖，而其他培养物中ANKA缺乏相关HMM命中时海藻糖稀少，提示主导ANKA可能是主要二糖产生者。平行研究（Stock et al., 2026）发现AOM活性沉积物中二糖的碳同位素特征更接近SRB相关脂质，但也可能因ANME脂质与总生物量之间存在同位素分馏而产生误差，需进一步验证。关于功能，二糖可能作为碳和能量储备，在硫酸盐存在时被ANKA通过糖酵解代谢为乙酸并最终氧化为CO₂；也可能是已知的海洋生物渗透调节物质，但培养物维持恒定近海水盐度使渗透胁迫不太可能；还可能作为胞外聚合物(EPS)的前体，通过海藻糖-麦芽糖磷酸化酶或麦芽糖型海藻糖异构酶将海藻糖与麦芽糖互变，促进1,4-键聚合物的形成，甚至可能通过掺入电子载体支持菌群成员间的直接种间电子传递。快速外源海藻糖被异养微生物消耗而核心菌群不同化的实验结果表明，富集物中积累的二糖可能位于细胞内或难以降解的EPS中，不易被异养生物利用，但ANKA-SRB菌群分泌的二糖仍可能支撑深海沉积物中部分异养微生物群落。

研究结论：尽管存在活跃的异养微生物，大量二糖库的持续存在表明ANKA-SRB菌群维持着一个活跃的糖经济体系。ANKA菌群可能维持一个深海沉积物"屏障生物圈"（barrier biome），在该体系中烷烃氧化与二糖分泌相耦合，支持代谢整合的次级异养微生物组合。不同的ANKA-SRB配对产生特征性的糖信号谱，塑造周围的微生物群落结构。虽然这些观察来源于富集培养物，但揭示了先前未被认知的原位碳交换系统。将研究从富集培养物拓展至原位条件，将有助于完善沉积物碳循环模型，揭示地球上最大微生物栖息地之一的碳通量调控机制。