BMP4和FGF2促进猪扩展潜能干细胞中包括胚外谱系的异质性启动

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：BMP4 and FGF2 promote heterogeneous priming including extraembryonic lineages in porcine expanded potential stem cells

　　

摘要

引言：胚外谱系，特别是滋养外胚层（trophectoderm, TE）和原始内胚层（primitive endoderm, PrE），对于早期胚胎发生和成功妊娠必不可少。扩展潜能干细胞（expanded potential stem cells, EPSCs）能够贡献于胚胎和胚外命运，为模拟早期谱系特化提供了平台。

方法：本研究调查了成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2, FGF2）和骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4, BMP4）（2F条件）对猪扩展潜能干细胞（porcine EPSCs, pEPSCs）中谱系相关启动的影响。

结果：经2F处理后，细胞维持正常核型并发生形态学变化，伴随多能性标志物（OCT4、SOX2）下调和TE标志物（CDX2和GATA3）及PrE标志物（GATA4、GATA6、SOX17和HNF4A）上调。转录组学和免疫荧光分析一致证明TE和PrE相关分子程序被激活，尽管也检测到其他发育谱系的标志物。这些发现表明，FGF2和BMP4联合处理促进了pEPSCs中胚外谱系相关启动，并产生了一个同时表现出TE和PrE相关状态特征的异质性群体。

讨论：总之，本研究建立了一个简单且限定的体外平台，用于研究猪EPSCs中信号依赖的谱系启动和细胞状态重塑。

论文解读

胚外谱系，包括滋养外胚层（trophectoderm, TE）和原始内胚层（primitive endoderm, PrE），对早期胚胎发生和成功妊娠至关重要。TE作为胎盘的祖细胞，分化为多种滋养层亚型；PrE则形成卵黄囊的内脏和内胚层，为胚胎提供营养和信号支持。扩展潜能干细胞（expanded potential stem cells, EPSCs）能够同时贡献于胚胎和胚外命运，因此成为研究早期谱系特化的理想平台。然而，猪作为重要的临床前大动物模型，其胚外谱系诱导条件仍不完善，现有猪blastoid模型中胚外谱系发育不完全。在人和小鼠中，骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4, BMP4）常用于诱导滋养层分化，成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor, FGF）信号则参与原始内胚层/XEN细胞衍生。但猪EPSCs中高效、简化的胚外谱系诱导方案仍缺乏，因此本研究旨在探索一种简单的两因子组合是否能够促进猪EPSCs的胚外谱系相关启动。

研究人员将来自体外受精和孤雌胚胎的pEPSCs（由Sang-Hwan Hyun教授提供）在含FGF2和BMP4的2F条件下培养3天。结果发现，2F处理后细胞维持正常核型，但形态发生改变，多能性标志物OCT4和SOX2下调，TE标志物CDX2、GATA3以及PrE标志物GATA4、GATA6、SOX17、HNF4A上调。转录组和免疫荧光分析一致表明TE和PrE相关分子程序被激活，同时检测到额外发育谱系的标志物，提示2F条件诱导产生了一个异质性群体，表现出TE和PrE相关状态的特征。该研究建立了一个简单且限定的体外平台，用于研究信号依赖性谱系启动和细胞状态重塑。相关成果发表在《Frontiers in Cell and Developmental Biology》。

在技术方法上，研究人员使用了多种关键手段。pEPSCs来自体外受精和孤雌胚胎，由Sang-Hwan Hyun教授提供，培养于小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）饲养层上。诱导时采用25 ng/mL FGF2和10 ng/mL BMP4处理3天。主要检测方法包括RT-qPCR分析标志物mRNA表达、免疫荧光染色检测蛋白分布、碱性磷酸酶活性评估多能性丧失、核型分析检查染色体完整性、bulk RNA-seq进行全转录组分析，并使用FGF受体抑制剂SU5402和BMP受体抑制剂LDN193189探究信号通路依赖性，最后通过基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析解析功能变化。

在结果部分，研究人员首先筛选了信号条件。通过比较以FGF4或FGF2为基础的7因子（7F）、4因子（4F）和2因子（2F）条件，发现FGF4组合对猪细胞诱导PrE标志物效果有限。而FGF2与BMP4组成的2F条件可显著下调OCT4和SOX2，并显著上调CDX2、GATA4、GATA6、SOX17和HNF4A，因此被选定用于后续实验。

随后，研究人员对2F处理的细胞进行了系统表征。形态学上，2F处理细胞由圆顶状致密克隆转变为扁平状，并分为致密和非致密两种类型；碱性磷酸酶活性完全丧失，表明多能性特征消失；核型分析显示染色体组成正常，说明遗传稳定性维持。RT-qPCR和免疫荧光结果显示，单独FGF2或BMP4仅诱导部分标志物变化，而联合2F处理则协同增强TE和PrE相关标志物表达。免疫荧光还显示，SOX2和CDX2在2F条件下呈互斥表达，TE标志物CDX2和PrE标志物HNF4A也分别出现在不同细胞亚群中，表明诱导群体呈现异质性而非统一的双潜能状态。抑制剂实验中，FGF信号抑制导致增殖下降及部分PrE标志物减少；BMP信号抑制则更广泛地下调PrE和TE相关基因表达，提示BMP信号在谱系启动中发挥更核心的作用。

转录组分析进一步揭示了2F处理对细胞身份的整体影响。Bulk RNA-seq显示，2F处理细胞与未处理pEPSCs的转录组谱显著分离，多能性相关基因NANOG、SOX2、PRDM14及pEPSC相关标志物DUSP6下调，而TE相关基因（CDX2、ELF5、GATA3、HAND1、TFAP2C、KRT7等）和PrE相关基因（GATA4、GATA6、SOX17、PDGFRA、HNF1B等）显著上调。此外，还检测到羊膜（VTCN1、TAC3等）、中胚层（PAX2、ISL1等）和外胚层（LEF1、PAX6等）标志物的表达。GO分析显示富集于转录调控、细胞增殖和膜相关过程。这些结果表明，2F处理驱动了从多能状态向广泛转录重塑的转变，而非定向分化为单一谱系。

讨论部分指出，FGF2比FGF4更适合猪细胞的PrE诱导，可能与人猪FGF4序列保守性较低有关。BMP4在猪中同样促进TE相关程序，但同时也激活羊膜相关标志物，提示其诱导的是更广泛的异质性谱系启动状态。抑制剂实验表明BMP信号在调节谱系相关基因表达中起主导作用。研究人员强调，2F处理并未产生完全成熟的XEN或滋养层干细胞，而是形成具有胚外谱系分子特征的异质性启动群体。此外，细胞表达XEN特异性标志物NID2和HNF1B，支持其更接近PrE/XEN样状态而非定型内胚层。

研究结论部分翻译如下：总之，本研究表明，BMP4和FGF2的简单限定组合（2F条件）可在pEPSCs中诱导PrE和TE相关分子程序，并伴随胚外谱系相关特征的获得。2F处理细胞还表现出更广泛的发育可塑性。这些结果为研究猪干细胞模型中早期谱系转变动态、信号依赖性细胞状态重塑以及胚外谱系启动机制提供了有价值的研究框架。