LMOD2与一种lncRNA的等位基因组合与查尔斯王骑士猎犬黏液瘤性二尖瓣疾病显著相关

《Animal Genetics》：A Combination of Alleles in LMOD2 and a lncRNA is Strongly Associated With Myxomatous Mitral Valve Disease in Cavalier King Charles Spaniels

　　

此前的全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）研究确定了与查尔斯王骑士猎犬（Cavalier King Charles Spaniels, CKCS）早发性黏液瘤性二尖瓣疾病（myxomatous mitral valve disease, MMVD）相关的犬染色体（canine chromosome, cfa）13和14区域。在本研究中，研究人员对9例CKCS病例（4.5岁前出现二尖瓣反流（mitral regurgitation, MR）或任何年龄因MMVD发生充血性心力衰竭（congestive heart failure, CHF））和10例CKCS对照（8岁后无或轻度MR）进行了全基因组测序（whole genome sequencing, WGS），在MMVD相关的cfa13和cfa14区域鉴定出超过2000个遗传变异。Ensembl变异效应预测器（Variant Effect Predictor, VEP）预测了18个变异可能具有功能影响。研究人员在250只CKCS（117例病例和133例对照）中对这些变异进行了基因分型。最显著相关的变异包括cfa13上长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）中的一个剪接位点变异、HYAL4中的一个非同义变异、LMOD2中的一个39碱基对插入以及ENSCAFG00000024436中的一个同义变异（p值从2.03E-08到4.20E-06）。LMOD2和lncRNA中风险等位基因的同时纯合性相对于非风险等位基因纯合性，其MMVD的比值比（odds ratio, OR）为52.5（p = 0.00034，95%置信区间：8.8–1023.8）。该基因变异组合在独立队列中得到验证后，有望在CKCS中实施靶向育种计划，以降低MMVD的患病率。

黏液瘤性二尖瓣疾病（myxomatous mitral valve disease, MMVD）是犬最常见的心脏病，查尔斯王骑士猎犬（Cavalier King Charles Spaniels, CKCS）具有显著易感性。该病与人类原发性二尖瓣脱垂（primary mitral valve prolapse, MVP）共享多种病理特征，包括细胞外基质积累和胶原纤维断裂，导致瓣膜增厚、脱垂及二尖瓣反流。MMVD随年龄进展，可发展为心脏扩大和充血性心力衰竭（congestive heart failure, CHF），严重威胁患犬生命。既往研究已证实遗传因素在MMVD中发挥重要作用，一项全基因组关联分析（genome-wide association study, GWAS）在CKCS中定位到犬染色体（canine chromosome, cfa）13和14上的两个早发性MMVD关联位点，但具体致病变异尚未明确。此外，NEBL基因附近变异在腊肠犬中被报道与MMVD相关，但其在CKCS中的作用需进一步验证。因此，本研究旨在通过全基因组测序（whole genome sequencing, WGS）和后续关联分析，精确定位cfa13和cfa14区域内的候选因果变异，并评估其与MMVD的关联及组合效应，为遗传检测和靶向育种提供科学依据。该研究成果发表于《Animal Genetics》。

研究人员对9例早发MMVD病例（4.5岁前出现二尖瓣反流或任何年龄因MMVD发生CHF）和10例健康对照（8岁后无或轻度二尖瓣反流）进行了WGS，在cfa13和cfa14区域共鉴定出2338个变异。通过Ensembl变异效应预测器（Variant Effect Predictor, VEP）筛选出19个潜在功能变异，其中18个成功基因分型。在250只CKCS（117例病例，133例对照）中的关联分析显示，cfa14上的MMVD15和MMVD16达到全基因组显著水平（p = 3.66E-08和p = 2.03E-08），cfa13上的MMVD10为最显著信号之一（p = 4.20E-06）。LASSO回归分析筛选出MMVD10和MMVD16作为最显著的预测因子。联合分析表明，当LMOD2基因的39碱基对插入（MMVD16）风险纯合子与lncRNA剪接位点变异（MMVD10）纯合子或杂合子同时存在时，MMVD的比值比高达52.5（95%置信区间：8.8–1023.8），风险远高于单一变异。此外，MMVD16在101个其他犬种或品种变体中未检出，提示其为CKCS特有或极罕见变异。相反，既往发现的NEBL附近变异在本研究队列中与MMVD无显著关联。这些发现为MMVD的分子病理机制提供了新见解，并为CKCS遗传育种筛选提供了潜在标记。

主要关键技术方法如下：样本来自丹麦哥本哈根大学和瑞典农业科学大学1999–2018年间收集的超过1000只私有CKCS的血液样本，病例和对照依据心脏听诊和超声心动图标准严格定义。对19只犬进行WGS（Illumina HiSeq4000平台，150 bp双端读长），序列比对至CanFam4参考基因组，GATK软件进行变异检测。使用Ensembl VEP注释变异功能，选择候选变异。SNP分型采用TaqMan探针法，LMOD2插入变异通过PCR和毛细管凝胶电泳检测。统计方法包括Fisher精确检验、LASSO多元Logistic回归、多元Logistic回归及PLINK v1.9计算连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）。

研究结果分述如下：

**全基因组测序与变异筛选**：在cfa13区域鉴定出374个变异，cfa14区域鉴定出1964个变异，所有病例均为非参考等位基因纯合且病例等位基因频率至少为对照的1.5倍。VEP注释得到19个候选变异，包括外显子、剪接位点突变及插入变异。

**基因分型与关联分析**：在250只CKCS中成功分型18个变异。Fisher精确检验显示，MMVD15（同义变异，p = 3.66E-08）和MMVD16（LMOD2插入，p = 2.03E-08）在全基因组范围内显著，MMVD14（HYAL4非同义变异，p = 7.28E-08）接近阈值。cfa13上的MMVD6（lncRNA外显子变异，p = 3.11E-06）和MMVD10（lncRNA剪接供体变异，p = 4.20E-06）为最强信号。LD分析显示MMVD14、MMVD15和MMVD16紧密连锁（LD接近1），而MMVD10与多个cfa13标记连锁。

**LASSO回归与组合分析**：基于基因型相似度筛选出9个非高度相关变异进行LASSO回归，识别出MMVD10和MMVD16为最佳预测组合。多因素Logistic回归显示，MMVD16风险纯合子单独存在时OR为9.31（95%CI：3.42–30.26），但当MMVD10同时携带一个或两个风险等位基因时，OR升高至48或52。这表明两个位点的等位基因组合显著增加MMVD风险。

**NEBL变异关联验证**：四个NEBL附近变异在本研究队列中均未达到统计学显著关联（p值范围0.56–1），但参考等位基因频率极低（0.04–0.07），与既往研究一致。

**其他犬种验证**：在1174只代表101个品种的犬中，MMVD16仅以杂合状态出现在两只拉戈托罗马尼奥洛犬中，其余品种未检出；MMVD10和其他变异则存在于多个品种中。这提示MMVD16可能是CKCS特异性风险因子。

讨论部分总结了MMVD10和MMVD16的潜在功能意义。MMVD10位于预测lncRNA ENSCAFG00000045150的剪接受体位点，lncRNA已知在心脏发育和病理中发挥调节作用，但该特定变异的功能需进一步研究。MMVD16是LMOD2基因外显子1中的39 bp插入，导致13个氨基酸重复（p.Met71-Glu83dup），该区域对应leiomodin-2蛋白的ABS1h结构域，对肌动蛋白结合至关重要。研究人员推测该插入可能改变心肌细丝长度，影响心肌收缩功能，进而对二尖瓣装置产生异常机械应力，成为MMVD的始动因素。此外，MMVD14（HYAL4 p.Ser5Pro）虽与MMVD显著关联，但该变异在多个非易感品种中也存在，且氨基酸替换不影响功能位点，故其致病可能性较小；MMVD15为同义变异，被认为候选性不强。

研究结论部分翻译如下：总之，本分析显示，在CKCS队列中，LMOD2中39 bp插入（MMVD16）的纯合性，与lncRNA剪接位点突变（MMVD10）的纯合性或杂合性组合，与MMVD强相关，比值比为52（95%置信区间8.75–1023.85），分别取决于剪接位点突变（MMVD10）中存在两个或一个非参考等位基因。本研究中，既往发现的NEBL附近变异均未与MMVD相关；然而，由于参考等位基因频率较低，与既往CKCS研究观察一致，仍需进一步研究阐明NEBL附近变异的影响。在本研究中，两个新遗传标记MMVD16和MMVD10能够识别具有高MMVD风险的犬。然而，这两个标记识别早发性MMVD的能力需要在独立CKCS队列中得到验证。这项研究支持在旨在降低CKCS中MMVD患病率的育种计划中纳入遗传检测的可能性。