矿物质和尿素转运相关基因在饲喂氮和/或钙减少日粮的青年山羊唾液腺和瘤胃上皮中的表达

《Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition》：Expression of Mineral and Urea Transport-Related Genes in the Salivary Glands and Ruminal Epithelium of Young Goats Fed Nitrogen- and/or Calcium-Reduced Diets

　　

蛋白质和矿物质的充足供应，特别是氮（N）和钙（Ca），对于反刍动物的生长和代谢功能至关重要。瘤胃和唾液腺通过特化的转运蛋白对营养素和电解质稳态起关键作用。日粮中N和Ca的减少可能引发适应性的分子和生理反应，但其对上皮转运的影响尚未完全了解。本研究调查了日粮N和Ca减少对青年山羊瘤胃和唾液液体组成以及瘤胃上皮和唾液腺中Ca、磷酸盐（Pi）和尿素转运蛋白mRNA表达的影响。山羊接受N减少、Ca减少或N和Ca联合减少的日粮。分析了瘤胃液、皱胃液、唾液和组织样品中的矿物质浓度、尿素和短链脂肪酸（SCFAs）。使用qPCR定量了转运蛋白的mRNA表达，包括CASR、TRPC3、TRPV3、PMCA、NCX1、UTB、SLC4A4、ATP1B1（Na⁺/K⁺-ATP酶β亚基）、AQP5、NaPi IIb和PiT1。日粮N减少降低了瘤胃和唾液中的尿素浓度，降低了唾液腺中SLC4A4、AQP5和NaPi IIb的mRNA表达，并降低了瘤胃SCFA浓度，表明微生物发酵受损。日粮Ca减少增加了唾液Pi并诱导AQP5、ATP1B1和PiT1的上调。在瘤胃上皮中，N减少增加了PMCA和UTB的表达，而Ca减少对Ca转运蛋白仅有轻微影响。瘤胃Pi和Ca浓度保持稳定，反映了瘤胃环境中矿物质浓度的强烈稳定化，而皱胃液对日粮变化表现出更高的敏感性。这些结果表明反刍动物上皮对日粮N和Ca减少具有组织特异性的转录和组成反应。N减少主要影响与营养素和溶质转运相关的基因表达，而Ca减少与矿物质相关转运蛋白的选择性转录变化有关。这些结果为上皮对营养变化的适应性反应提供了证据，尽管蛋白质或转运水平上的功能后果仍需进一步研究。

蛋白质和矿物质，特别是氮（N）和钙（Ca），是反刍动物生长和代谢功能所必需的。蛋白质是反刍动物日粮中最昂贵的成分之一，而过量N摄入又会增加环境负担，因此降低日粮蛋白质含量成为研究热点，前提是维持生长性能和生理功能。已有研究表明，日粮N减少会影响青年山羊的矿物质稳态，尤其是降低肠道Ca吸收，这与小肠Ca转运蛋白下调有关，提示N供应不足可能通过内分泌机制损害Ca稳态。瘤胃和唾液腺依靠特化转运蛋白在矿物质平衡和N代谢中发挥核心作用。然而，日粮N和Ca减少对上皮转运的影响尚未完全阐明。基于此，研究人员假设日粮N减少单独或与Ca供应改变组合可能影响瘤胃和唾液矿物质及尿素转运过程的功能和转录水平。该研究旨在测定接受N和/或Ca减少日粮的青年山羊瘤胃上皮和唾液腺中选定转运蛋白的mRNA表达水平。

该研究发表于《Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition》。研究使用了来自先前实验（Elfers et al. 2015）的26只8周龄雄性彩色德国山羊，随机分为四组：对照组（N+/Ca+，21%粗蛋白，1%Ca）、N减少组（N?/Ca+，8%粗蛋白，1%Ca）、Ca减少组（N+/Ca?，22%粗蛋白，0.4%Ca）以及N和Ca联合减少组（N?/Ca?，8%粗蛋白，0.4%Ca），饲喂6至8周。研究人员分析了瘤胃液、皱胃液、唾液的矿物质浓度、尿素和短链脂肪酸（SCFAs），并通过定量PCR（qPCR）检测了瘤胃上皮和唾液腺中钙敏感受体（CASR）、TRPC3、TRPV3、质膜Ca²⁺-ATPase（PMCA）、钠钙交换体1（NCX1）、尿素转运蛋白B（UTB）、碳酸氢钠共转运体（SLC4A4）、Na⁺/K⁺-ATPase β亚基（ATP1B1）、水通道蛋白5（AQP5）、IIb型钠磷转运体（NaPi IIb）和磷酸盐转运体1（PiT1）的mRNA表达。

关键技术方法：研究人员使用来自先前实验（Elfers et al. 2015）的26只山羊样本。采集唾液、腮腺、瘤胃腹侧囊组织及瘤胃液、皱胃液。生化测定采用商品试剂盒和分光光度法检测尿素、总Ca和无机Pi，气相色谱法测定SCFAs。RNA提取后逆转录，使用SYBR Green和TaqMan探针进行qPCR，以18S rRNA（唾液腺）和β-actin（瘤胃上皮）为内参，采用双因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验进行统计。

研究结果：

3.1 采食量和生长性能
所有动物临床健康。初始体重在各组间相似（15.5–16.7 kg），最终体重从N?/Ca?组的21.07 kg到N+/Ca+组的23.93 kg，日增重0.15–0.18 kg/d。由于群饲，未进行统计分析，仅作描述性报告。

3.2 N和/或Ca减少日粮对瘤胃液和皱胃液生化参数的影响
瘤胃液中Ca和Pi浓度不受N或Ca减少的显著影响。N减少显著降低尿素浓度（p<0.0001）和SCFA浓度（乙酸、丙酸p=0.02，丁酸p<0.0001），并降低瘤胃pH（p=0.0002）。Ca减少仅降低乙酸浓度（p=0.03）。瘤胃pH存在显著的N×Ca交互作用（p=0.039）。皱胃液中，N和Ca减少均显著降低Ca浓度（分别为p=0.0017和p<0.0001）；Pi浓度在N减少时降低（p=0.035），在Ca减少时升高（p=0.0007），表现出相反效应。

3.3 N和/或Ca减少日粮对唾液生化参数的影响
唾液Ca浓度不受处理影响。Ca减少显著增加唾液Pi浓度（p=0.03），而N减少有降低趋势（p=0.06）。N减少显著降低唾液尿素浓度（p<0.0001）。无显著交互作用。

3.4 N和/或Ca减少日粮对瘤胃上皮选定靶基因mRNA表达的影响
以β-actin为内参。CASR、ATP1B1、NCX1和TRPV3表达在各组间无显著差异。N限制显著增加PMCA表达（p=0.02），并呈TRPC3表达升高趋势（p=0.09）；Ca减少有降低PMCA表达趋势（p=0.09）。SLC4A4表达受N减少显著影响（p=0.02），且存在N×Ca交互作用（p=0.01），并与瘤胃液尿素浓度正相关（r=0.58, p=0.005）。N减少刺激UTB表达（p=0.01），与瘤胃尿素浓度负相关（r=-0.42, p=0.05）。

3.5 N和/或Ca减少日粮对唾液腺选定靶基因mRNA表达的影响
以18S rRNA为内参。NCX1、PMCA和UTB表达不受影响。AQP5表达在N减少时显著降低（p<0.0001），Ca减少时升高（p=0.0042），存在显著交互作用（p<0.0001）。Ca减少显著增加ATP1B1（p=0.01）和PiT1（p=0.05）表达。NaPi IIb（p=0.07）、TRPC3（p=0.07）和CASR（p=0.09）在N减少下呈降低趋势。SLC4A4存在显著交互作用（p=0.0092）。

总结讨论：讨论指出，瘤胃液中Pi和Ca浓度稳定，反映了唾液Pi分泌和瘤胃缓冲系统的强稳定作用。皱胃液中矿物质变化更明显，与酸性环境下Ca和Pi溶解性改变有关。N减少导致瘤胃尿素和SCFA降低，提示微生物发酵受损。唾液腺和瘤胃上皮的转录反应呈组织特异性：N减少主要影响与水和溶质转运相关的基因（如AQP5、SLC4A4、NaPi IIb），而Ca减少则选择性上调矿物质相关转运蛋白（如PiT1、ATP1B1）。SLC4A4下调可能与SCFA产生减少导致的上皮转运需求改变有关，而非酸中毒。UTB表达增加可能有助于N限制下尿素N循环的灵活性。AQP5和SLC4A4的N×Ca交互作用提示低Ca条件下的转录反应依赖于N供应。

结论：反刍动物上皮对日粮营养限制表现出组织特异性的转录和组成反应。N减少与上皮基因表达和体液组成的变化相关，与营养可利用性和微生物发酵改变一致；而Ca减少则在唾液腺中诱导矿物质转运相关基因的选择性转录变化。尽管少数变量（瘤胃pH、SLC4A4和AQP5）显示N×Ca交互作用，但大多数参数独立响应。因此，本研究中观察到的N代谢与Ca稳态之间的任何联系应视为关联性，而非直接调控相互作用的证据。该研究主要基于mRNA表达和体液组成数据，不能直接推断蛋白质丰度、转运体活性或功能转运速率。尽管如此，观察到的体液和转录变化提示唾液、瘤胃和皱胃之间存在协调的生理调节，可能在日粮限制下维持矿物质和N平衡，为未来整合分子、蛋白质水平和功能转运测量的研究提供了基础。