基于线的微流控电化学平台用于全血蛋白传感：以内源性尿酸为氧化还原介体

《Lab on a Chip》：A thread-based microfluidic electrochemical platform for whole-blood protein sensing using endogenous uric acid as a redox mediatorOpen Access

　　

全血中的电化学蛋白传感仍具挑战性，因为许多现有检测依赖于外部氧化还原探针、洗涤步骤以及血浆分离等芯片外预处理。研究人员在此提出一种线基微流控电化学平台，通过利用内源性尿酸（uric acid, UA）作为氧化还原介体，在无外部氧化还原试剂条件下实现全血中的蛋白相关传感。该器件将毛细驱动的血浆分离与电化学检测集成于紧凑形式中。在丝线网络内，血细胞通过Ca²⁺诱导的聚集机制被截留，从而无需离心即可将血浆递送至电极界面。目标识别基于阻断型机制，其中抗原-抗体复合物的形成抑制UA的氧化电流。以C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）作为模型目标，该平台在临床相关范围内表现出浓度依赖性响应。在磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline, PBS）中的检测限（limit of detection, LOD）为0.091 mg dL^?1，在集成式血液器件配置中为0.106 mg dL^?1。在逐步CRP加标回收实验中，三个浓度水平的回收率分别为103.9%、99.6%和99.8%，所有相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）值均低于1.20%。这些结果证明了所提出传感平台具有优异的分析准确度和重现性。在所测试的生理相关尿酸浓度范围内，基于抑制的信号得以保持，表明传感响应对内源性尿酸水平的适度变化相对不敏感。在初步猪炎症模型中，CRP相关传感器响应与白细胞（white blood cell, WBC）计数呈现延迟的时间关联，在约180 min的滞后时间处最大互相关R = 0.85。综上所述，这些结果验证了利用内源性电活性分子直接从全血进行无试剂蛋白传感的可行性。本研究引入了一种简单的样本到答案线基微流控平台，并突出了无需外部氧化还原介体的分散式生化分析新策略。

全血中的蛋白定量检测在临床诊断和即时检测（point-of-care testing, POCT）中具有重要意义。然而，现有的电化学免疫测定通常依赖外部氧化还原探针、酶标记及多步洗涤，且常需通过离心获得血清，难以满足床旁、家庭医疗和资源有限环境对简单、快速和便携性的需求。同时，全血中的细胞成分易在电极表面造成生物污染，而传统微流控器件又面临制造复杂、依赖外部泵阀等问题。针对这些局限，研究人员提出了一种线基微流控（thread-based microfluidic）电化学平台，利用血液中天然存在的尿酸（uric acid, UA）作为内源性氧化还原介体，无需添加任何外部氧化还原试剂，即可直接从全血中检测蛋白生物标志物。该研究以C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）为模型靶标，将毛细驱动的血浆分离与电化学检测集成于一个紧凑器件中，仅需10 μL全血即可在约10 min内完成检测。

在关键技术方法上，研究人员主要采用了以下策略：其一，利用Tencel纤维编织的多孔结构负载CaCl₂，通过Ca²⁺诱导血细胞聚集并结合物理截留，实现无离心的血浆分离；其二，采用聚酰胺-胺（PAMAM）树状大分子构建三维抗体固定层，提高电极表面的抗体密度和分子捕获效率；其三，使用差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry, DPV）记录UA氧化电流的变化，并以电流抑制率作为定量输出。动物实验样本来源于一例雌性长白猪（体重48.4 kg），通过腹腔注射自体粪便悬液诱导全身炎症模型，对系列血样进行离体分析。

研究结果分为四个部分。第一部分为等离子体分离垫的评价。在血细胞分离的光学评价中，沿毛细流动路径的血细胞密度从入口的10956 cells/mm²逐步降至检测区附近的2038 cells/mm²，截留效率约80%，表明纤维网络与Ca²⁺聚集可有效去除血细胞。在毛细驱动传输评价中，液体前沿在2.5 s内推进约10 mm，平均流速约4 mm s^?1，体积流量为1.81 ± 0.12 μL s^?1，符合Lucas–Washburn模型，证明无需外泵即可实现快速稳定的血浆传输。SEM观察显示丝线具有多孔纤维网络结构，支持毛细流动和血细胞截留。

第二部分为电极性能与蛋白检测能力评价。在电极界面优化中，抗体固定浓度被优化为30 μg mL^?1；循环伏安法（cyclic voltammetry, CV）和DPV表征确认了逐级表面修饰成功，抗体固定后UA氧化电流降低，表明形成了绝缘生物层。在不同尿酸条件下的CRP检测中，双因素方差分析显示CRP浓度对抑制率有显著影响（F(2,30)=333.74, p<0.001），而UA浓度无显著影响（p=0.102），且无交互作用，说明抑制响应主要取决于CRP浓度，对UA水平变化相对稳健。PAMAM修饰电极的校准曲线线性更好（R²=0.9941），LOD为0.091 mg dL^?1，优于无PAMAM电极（R²=0.9219，LOD=0.244 mg dL^?1）。

第三部分为CRP传感系统的实际评价。在序贯CRP添加实验中，向猪血浆中逐步加入CRP后，DPV电流呈阶梯式下降，与估计浓度线性相关（R²=0.9987），集成血液器件配置中的LOD为0.106 mg dL^?1。选择性和稳定性测试表明，传感器对CRP有显著抑制响应，而对白蛋白、IgG、CaCl₂及NaCl、葡萄糖和乳酸混合液等干扰物响应很小；电极在4°C储存7天内响应保持在90%以上。分析回收率实验中，三个加标水平的回收率分别为103.9%、99.6%和99.8%，所有RSD均低于1.20%，显示出良好的准确性和重现性。

第四部分为猪炎症模型系列血样的离体分析。通过腹腔注射自体粪便悬液诱导全身炎症后，体温和WBC计数随时间升高，而CRP相关传感器响应呈现延迟升高，符合CRP作为急性期蛋白的时序特征。互相关分析显示，WBC计数与传感器响应在滞后约180 min时达到最大正相关（R=0.85），表明该平台能够反映连续血样中与炎症进展相关的时间变化。

在讨论部分，研究人员指出，残余血细胞虽可能靠近检测区，但实验表明其对电化学信号的干扰有限；在200–600 μM的UA浓度范围内，抑制信号保持稳定，说明利用抑制率作为读数可降低内源性UA波动的影响；PAMAM树状分子层显著改善了线性度和重现性。研究结论为：本研究开发了一种线基微流控电化学平台，无需外部氧化还原试剂，以内源性UA为介体实现全血蛋白传感。平台集成了毛细驱动血浆分离和电化学检测，仅需少量全血。以CRP为模型目标，在临床相关范围内获得浓度依赖性信号，并在不同UA浓度下保持性能。在集成血液器件中LOD为0.106 mg dL^?1（PBS中为0.091 mg dL^?1），表明血液基质影响有限。逐步加标测试显示传感器响应能够跟踪浓度变化，分析一致性良好。猪炎症模型的离体分析显示，传感器响应与WBC计数和体温之间存在时间关联，提示该平台有望用于连续血样中炎症相关变化的监测。