《Journal of Advanced Research》：A proactive immune training strategy to generate anticipatory immunity against viral evasion
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引言
RNA病毒快速进化以逃逸宿主免疫，对传统疫苗构成重大挑战。然而，自然感染通过训练免疫系统应对多样化抗原景观，为广泛免疫提供了蓝图。本研究旨在解决如何制造一种模拟这一复杂训练过程的疫苗。目标：研究人员旨在开发并验证一种新型疫苗接种范式——“主动免疫训练”（
引言
RNA病毒快速进化以逃逸宿主免疫，对传统疫苗构成重大挑战。然而，自然感染通过训练免疫系统应对多样化抗原景观，为广泛免疫提供了蓝图。本研究旨在解决如何制造一种模拟这一复杂训练过程的疫苗。目标：研究人员旨在开发并验证一种新型疫苗接种范式——“主动免疫训练”（Proactive Immune Training, PIT），其设计目标是增强针对预测进化空间内变异株的交叉反应中和广度。
方法
以SARS-CoV-2为模型，研究人员基于30个预测的高频突变位点构建了一个包含600个突变体的mRNA文库（m-library）。该文库被封装于专利脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）中，构成PIT疫苗。随后，研究人员在BALB/c小鼠中评估了一种序贯初免-加强方案，即单抗原（Single-Antigen, SA）疫苗初免后接PIT加强（SA+PIT），检测体液免疫和细胞免疫，并对B细胞和T细胞受体库进行深度测序。
结果
与传统方案相比，SA+PIT方案诱导了针对一系列SARS-CoV-2变异株显著更广谱且更强效的中和抗体。这种增强的保护作用在机制上与T细胞和B细胞受体库的深度多样化相关，这是卓越免疫适应性的标志。
结论
PIT策略成功引导免疫系统产生广泛且适应性的免疫应答。这种主动的、基于训练的新范式为开发针对高变异病原体的下一代疫苗提供了一个强大而通用的框架。
RNA病毒（如SARS-CoV-2）具有极高的突变率，可通过抗原漂移逃避宿主免疫，传统疫苗主要针对固定抗原，难以应对持续出现的新变异株。自然感染虽能提供“混合免疫”，但伴随重症和死亡风险。因此，需要一种主动应对病毒进化的新策略。研究人员受自然感染过程启发，提出“主动免疫训练”（Proactive Immune Training, PIT）策略，通过模拟病毒突变景观来引导免疫系统产生广谱保护。该研究以SARS-CoV-2为模型，构建了包含600个突变体的mRNA文库（mRNA library, m-library），封装于CMP1脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）中形成PIT疫苗，并在BALB/c小鼠中验证了“单抗原初免+PIT加强”（SA+PIT）方案。结果显示，该方案可显著增强交叉反应中和抗体和受体库多样性。该工作为高变异病原体的疫苗设计提供了新框架，论文发表于《Journal of Advanced Research》。
在核心技术方法上，研究人员利用PyR0模型（一种层次贝叶斯回归框架）分析约640万条来自GISAID的SARS-CoV-2基因组序列，预测Spike蛋白上30个高频突变位点，通过饱和突变构建600突变体DNA文库，再经体外转录生成mRNA文库。使用专利离子化脂质CMP1和微流控技术制备CMP1@mRNA纳米颗粒。动物包括购自北京华阜康生物科技股份有限公司的SPF级BALB/c和NIH小鼠（6-8周龄），细胞系包括293T和hACE2-293T（购自ATCC）。评价技术包括ELISA结合抗体检测、假病毒中和试验、流式细胞术、TCR/BCR深度测序以及血生化和组织病理学安全性评估。
研究结果包含以下五个方面：
1. 通过饱和突变生成全面的Spike变异文库。研究人员基于PyR0模型Z评分选择30个突变位点，进行饱和突变，得到600个S蛋白DNA质粒，包含570个独特单点突变（每个位点19种非野生型替代）及野生型。NGS验证文库覆盖率达98.4%，残留野生型频率0.25%，Gini系数0.17；体外转录后ELISA确认mRNA文库在293T细胞中表达良好。
2. CMP1 LNP递送系统表现出优越的转染效率。通过动态光散射、纳米流式、冷冻电镜等表征，CMP1@GFP粒径约100 nm，mRNA包封率90%，空颗粒率1.7%，转染效率较Lipofectamine? 2000提高2倍。体内成像显示CMP1@Fluc主要在肝、腿和脾表达；脾细胞分析显示CMP1增强树突状细胞（DCs）和中性粒细胞摄取；共聚焦实验显示CMP1@Cy5的溶酶体逃逸效率高于ALC-0315@mRNA。
3. PIT联合突变抗原文库增强体液免疫。SA+PIT组比SA+SA和PIT+PIT组产生更高的抗Spike IgG结合抗体和假病毒中和抗体滴度，尤其针对BA.5和BF.7等“未来”变异株。与六价鸡尾酒（WT+Alpha+Beta+Gamma+Delta+Omicron）相比，SA+PIT对BA.2诱导相当滴度，但对BA.5和BF.7的中和活性显著更高，表明突变库能填补已知变异株间的抗原空隙。
4. PIT
