利用香豆素优势骨架实现效力与选择性：缺氧靶向的烷基香豆素连接苯基喹唑啉酮类化合物作为具有化学增敏活性的双重hCA IX/HSP90α抑制剂

《RSC Advances》：Harnessing coumarin privilege to achieve potency and selectivity: hypoxia-targeted alkyl coumarin-tethered phenyl quinazolinones as dual hCA IX/HSP90α inhibitors with chemosensitizing activityOpen Access

　　

缺氧肿瘤区域由于细胞外酸化、化疗耐药以及肿瘤相关碳酸酐酶IX（tumor-associated carbonic anhydrase IX，hCA IX）、热休克蛋白90α（heat shock protein 90 alpha，HSP90α）和其他蛋白质的协同作用所促进的适应性机制，在乳腺癌治疗中仍然具有挑战性。受香豆素作为选择性hCA IX抑制剂和HSP90α调节剂的特权作用，以及苯基喹唑啉酮的ATP模拟特性和抗癌特性的启发，研究人员理性设计并合成了一系列烷基香豆素连接苯基喹唑啉酮类化合物（4a–l），作为缺氧靶向的双重hCA IX/HSP90α抑制剂。通过1H NMR、13C NMR-DEPTQ、HRMS、元素分析和HPLC明确确定了所合成化合物的结构。所合成的杂合体对hCA IX表现出强效、高选择性的抑制活性（纳摩尔范围），同时对脱靶亚型hCA I和II几乎无活性。化合物4b成为先导衍生物，对hCA IX的K_I值为51.7 nM，并具有卓越的选择性（较hCA I和hCA II高>1934倍）。值得注意的是，4b还表现出强效的HSP90α抑制活性（IC₅₀ = 13.21 nM），与ganetespib相当。此外，4b优先抑制缺氧条件下MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖，使其对阿霉素敏感，并诱导p53介导的线粒体凋亡。针对hCA IX和HSP90α的分子对接和分子动力学模拟，以及计算机ADME和毒性研究，进一步支持了先导化合物有利的结合行为、稳定性和类药特性。

**论文解读：缺氧靶向双重hCA IX/HSP90α抑制剂的设计、合成与抗乳腺癌活性研究**

**一、研究背景与目的**

乳腺癌是全球女性中最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因之一。尽管诊断和靶向治疗取得了显著进展，治疗耐药仍是重大临床挑战，尤其在侵袭性亚型中。肿瘤缺氧是乳腺癌微环境的一个标志性特征，可促进细胞外酸化、代谢重编程、侵袭转移和化疗耐药。这些适应性反应主要由缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）这一肿瘤生存和进展的关键转录调控因子所驱动。因此，利用缺氧相关的治疗脆弱性已成为开发能够克服乳腺癌化疗耐药的新型抗癌药物的重要策略。

在众多受HIF-1α调控的缺氧适应相关蛋白中，肿瘤相关碳酸酐酶IX（hCA IX）因其在正常组织中表达受限、而在包括乳腺癌在内的缺氧实体瘤中显著过表达而备受关注。hCA IX通过调节细胞外酸化和细胞内pH稳态，促进肿瘤生存、侵袭和化疗耐药，因此成为颇具吸引力的治疗靶点。虽然磺酰胺类化合物仍是研究最广泛的hCA抑制剂，但香豆素类化合物作为一类非磺酰胺抑制剂，表现出显著的亚型选择性。例如天然倍半萜香豆素colladonin对hCA IX和hCA XII表现出强效抑制活性（K_I = 90.0 nM和210.0 nM），而对hCA I和II活性较弱。此外，热休克蛋白90α（HSP90α）在缺氧肿瘤中同样成为重要的治疗靶点，其通过维持包括HIF-1α在内的多种致癌客户蛋白的稳定性，促进肿瘤生存和缺氧应激适应。香豆素类化合物如新生霉素（novobiocin）及其类似物已被确立为HSP90抑制的优势骨架。另一方面，zelavespib（PU-H71）等ATP模拟嘌呤衍生物通过占据ATP结合口袋展现出强效HSP90抑制活性。基于此，研究人员设想用具有ATP模拟特性的喹唑啉酮母核替代嘌呤母核，结合香豆素的选择性hCA IX抑制与HSP90调节功能，开发新型缺氧靶向的双重hCA IX/HSP90α抑制剂，以期通过互补机制破坏缺氧适应，抑制肿瘤生长并增敏传统化疗。

**二、研究内容概述**

本研究设计并合成了一系列烷基香豆素连接苯基喹唑啉酮类化合物（4a–l），作为缺氧靶向的双重hCA IX/HSP90α抑制剂。研究人员对合成化合物进行了hCA I、II、IX和XII抑制活性评价，随后在常氧和缺氧条件下对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞进行了抗增殖研究，并进一步考察了最具前景化合物的HSP90α抑制活性、对阿霉素（DOX）的化学增敏潜力、凋亡诱导效应以及分子对接和分子动力学模拟的结合行为，同时辅以计算机ADME和毒性研究。

**三、主要技术方法**

研究人员采用多步有机合成方法制备化合物，关键步骤包括：以邻氨基苯甲酸衍生物与苯基异硫氰酸酯反应合成2-巯基喹唑啉酮中间体；通过Pechmann缩合由间苯二酚与β-酮酸酯合成7-羟基香豆素衍生物；经O-烷基化和S-烷基化反应得到目标产物。结构表征采用1H NMR、13C NMR-DEPTQ、HMQC、HRMS（ESI）、元素分析和HPLC。生物学评价方面，采用 stopped-flow CO₂ 水合酶实验测定hCA抑制常数，MTT法评估抗增殖活性，荧光偏振法测定HSP90α N-末端ATP结合域抑制活性，qRT-PCR检测凋亡相关基因表达。计算研究方面，使用AutoDock Vina进行分子对接，GROMACS进行100 ns分子动力学模拟，gmx_MMPBSA计算结合自由能，ADMETlab 3.0和ProTox-II分别预测ADME性质和毒性。细胞实验所用样本为MCF-7（luminal A型，ER阳性）和MDA-MB-231（三阴性，高侵袭性）两种人乳腺癌细胞系，以及非致瘤性人乳腺上皮细胞MCF-10A作为正常对照。

**四、研究结果**

**化学合成与结构表征**

研究人员成功合成了12个目标化合物（4a–l），产率50–85%。所有化合物的结构均通过1H NMR、13C NMR-DEPTQ、HMQC、HRMS、元素分析和HPLC确认，纯度均大于95%。

**碳酸酐酶亚型抑制活性与选择性**

在hCA抑制活性评价中，所有化合物对胞质亚型hCA I和II的活性极弱（K_I = 70 500 至 >100 000 nM），而对肿瘤相关亚型hCA IX和XII表现出强效抑制，K_I值分别为51.7–148.7 nM和36.8–131.6 nM。构效关系（SAR）分析显示：喹唑啉酮环上引入氯原子可轻微增强甲基取代系列的hCA IX活性（4a→4d，K_I从58.6降至55.3 nM），但在正丙基（4b→4e，从51.7升至81.2 nM）和异丙基（4c→4f，从66.9升至101.3 nM）系列中则降低活性；将氯原子移至苯基环普遍降低活性；在异丙基系列中苯基环引入氯后添加额外氯原子反而改善活性（4i→4l，从148.7降至90.2 nM）。选择性方面，化合物4b表现出最优的hCA IX选择性，其选择性比值（SR）为I/IX > 1934.2和II/IX > 1934.2，远高于阳性对照乙酰唑胺（AAZ，SR I/IX = 10.0，SR II/IX = 0.5）和colladonin（SR I/IX = 32.2，SR II/IX = 111.1）。

**体外抗增殖活性**

基于hCA抑制活性和选择性，研究人员选择4a、4b、4d和4g进行进一步细胞研究。所有化合物在缺氧条件下较常氧表现出增强的抗增殖活性，而DOX则相反，在缺氧条件下活性降低。化合物4b为系列中最优成员，在常氧和缺氧条件下对MDA-MB-231细胞的IC₅₀分别为5.15和4.06 μM，对MCF-7细胞分别为7.18和4.99 μM。值得注意的是，缺氧条件下4b对两种细胞系的抗增殖活性均强于DOX。所有化合物对非致瘤性MCF-10A细胞表现出极低的细胞毒性（IC₅₀ > 50 μM），提示良好的体外安全性。

**化学增敏活性评价**

缺氧显著降低两种乳腺癌细胞系对DOX的敏感性，DOX对MDA-MB-231细胞的IC₅₀从常氧的1.65 μM升至缺氧的8.90 μM，对MCF-7细胞从2.38升至6.58 μM。在缺氧条件下，DOX + 4b联合治疗显著增强抗增殖活性，将DOX的IC₅₀从8.90降至2.09 μM（MDA-MB-231细胞）和从6.58降至3.94 μM（MCF-7细胞），分别改善约4.3倍和1.7倍。这种改善在常氧条件下未观察到，表明4b可特异性地使缺氧乳腺癌细胞对DOX增敏。

**HSP90α抑制活性**

化合物4a、4b、4d和4g对HSP90α N-末端ATP结合域均表现出纳摩尔级抑制活性，IC₅₀范围13.21–43.24 nM。其中4b活性最强（IC₅₀ = 13.21 ± 1.54 nM），与参考抑制剂ganetespib（IC₅₀ = 12.15 ± 0.70 nM）相当。香豆素C-4位烷基链延长有利于HSP90α抑制活性，而喹唑啉酮环或N3-苯基环上的氯取代则产生不利影响。

**凋亡机制研究**

在缺氧条件下以IC₅₀浓度处理MDA-MB-231细胞72小时后，qRT-PCR显示4b显著上调促凋亡标志物p53（3.12倍）、caspase-9（5.16倍）和BAX（3.12倍）的表达，同时下调抗凋亡基因Bcl-2（0.51倍），BAX/Bcl-2比值从1.00升至6.12，表明4b通过p53介导的线粒体（内源性）凋亡途径诱导细胞凋亡。

**计算机模拟研究**

分子对接显示，化合物4b的水解开环产物（Z-2-羟基肉桂酸衍生物）在hCA IX活性位点具有有利的结合构象（对接分数?8.35 kcal mol^?1），其羧酸根与催化Zn²⁺离子及His68、His94等残基相互作用；在HSP90α的N-末端ATP结合口袋中，4b同样呈现良好结合构象（对接分数?7.24 kcal mol^?1），与水介导的Asp93氢键及多种疏水相互作用有关。100 ns分子动力学模拟表明，4b与hCA IX和HSP90α形成的复合物在整个模拟过程中保持稳定，RMSD、RMSF、回转半径（Rg）和溶剂可及表面积（SASA）分析均未显示靶蛋白结构失稳。MM/PBSA结合自由能计算显示，hCA IX-4b复合物的ΔG_bind = ?83.09 ± 0.28 kcal mol^?1（主要由静电相互作用驱动），HSP90α-4b复合物的ΔG_bind = ?21.75 ± 0.32 kcal mol^?1（主要由范德华相互作用驱动）。计算机ADME预测显示4b具有均衡的药代动力学特征，与ganetespib、colladonin和novobiocin相当；ProTox-II毒性预测显示4b总体安全性较好，但均需实验验证。

**五、讨论与结论**

研究人员成功设计并合成了一系列新型烷基香豆素连接苯基喹唑啉酮类化合物（4a–l），作为缺氧靶向的双重hCA IX/HSP90α抑制剂。这些杂合体对hCA IX表现出强效、高选择性的抑制活性，同时对脱靶亚型hCA I和II几乎无活性。其中化合物4b为先导衍生物，对hCA IX的抑制常数为51.7 nM，选择性超过1934倍，对HSP90α的IC₅₀为13.21 nM，与ganetespib相当。4b还能优先抑制缺氧乳腺癌细胞增殖，使细胞对DOX增敏，并通过p53介导的线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。分子对接、分子动力学模拟及计算机ADME/毒性研究进一步支持了其有利的结合行为和类药特性。

本研究证明了合理设计的烷基香豆素连接苯基喹唑啉酮类化合物能够将hCA IX和HSP90α的强效选择性生化抑制与缺氧条件下的抗肿瘤活性结合于一体，支持将双重hCA IX/HSP90α抑制作为对抗乳腺癌化疗耐药的潜在策略。然而，研究也存在局限性：观察到的细胞效应是否特异性地由hCA IX和HSP90α的同时抑制所介导，仍需通过基因敲低等靶点验证研究加以直接确证；此外，体内实验的缺失也是本研究的局限，先导化合物4b的靶点依赖性、抗肿瘤疗效、安全性、药代动力学行为和靶点占有情况均有待进一步的机制和体内研究加以验证。