开发一种多重聚合酶链反应检测方法，用于区分与鱼类乳球菌病相关的三种乳球菌属物种

《Journal of Fish Diseases》：Development of a Multiplex Polymerase Chain Reaction Assay for Differentiating Three Lactococcus Species Associated With Piscine Lactococcosis

　　

鱼类乳球菌病（piscine lactococcosis）是养殖鱼类的一种重要细菌性疾病。其病原体包括格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、Lactococcus petauri和Lactococcus formosensis，三者亲缘关系密切，使物种水平的鉴定复杂化。研究人员通过比较基因组分析鉴定物种特异性基因，开发了一种常规多重聚合酶链反应（PCR）检测方法。对441个公开可用的基因组装配体进行平均核苷酸一致性（average nucleotide identity, ANI）重新分配，鉴定出111个L. garvieae、255个L. petauri和75个L. formosensis基因组。研究人员使用基于计算机模拟的聚合酶链反应（in silico PCR）对目标基因组及代表12个属474个类群的10,460个非目标装配体评估了物种特异性引物和基于tuf的乳球菌通用对照（Lactococcus common control）。实验特异性使用6株目标菌株和19株非目标鱼类病原体进行评估。分别产生了195 bp、333 bp和500 bp的L. garvieae、L. petauri和L. formosensis特异性扩增子，以及一个132 bp的对照扩增子。未观察到交叉扩增。在混合DNA样品和来自两种鱼类的加标肾脏和脾脏匀浆中均检测到所有目标物种。分析检测限根据DNA提取前细菌悬液的显微镜细胞计数估算，范围为每反应0.956至8.55个细胞当量。该方法利用标准PCR和琼脂糖凝胶电泳，为区分致乳球菌病的乳球菌属物种提供了一种快速、低成本的方法。

鱼类乳球菌病（piscine lactococcosis）是影响全球养殖鱼类的重要细菌性疾病，其病原体包括格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、Lactococcus petauri和Lactococcus formosensis。这三种细菌均能引起全身性出血、败血症和眼部炎症，仅凭临床症状难以区分。由于遗传关系密切，表型鉴定方法如API生化谱、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）以及16S rRNA基因分析等均不能稳定地实现物种水平鉴定，导致病原体身份和流行病学分布不清。准确的物种鉴定对病因诊断、流行病学监测和防控措施选择至关重要。目前已有的常规多重聚合酶链反应（PCR）检测方法只能覆盖其中两种物种：Ustaoglu等的方法可检测L. garvieae和L. petauri，但不检测L. formosensis，且对日本某些流行分离株失效；Araki等的方法可检测L. garvieae和L. formosensis，但不检测L. petauri。虽然已有基于TaqMan探针的多重定量PCR可同时区分三种，但常规PCR因仅需标准热循环仪和琼脂糖凝胶电泳，更适合缺乏定量PCR仪器的实验室。因此，本研究旨在开发一种能同时区分三种致乳球菌病乳球菌的常规多重PCR方法。

研究人员对公开可用的基因组序列进行比较基因组分析，鉴定三种物种各自保守且特异的基因，在此基础上设计引物并开发了常规多重PCR检测方法。