《RSC Advances》：Cross-docking and redocking reveal distinct determinants of success in physics-based and AI-driven binding pose prediction in protein–ligand complexesOpen Access
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交叉对接与重对接揭示基于物理和人工智能驱动的蛋白质-配体复合物结合姿态预测中成功的不同决定因素
蛋白质-配体姿态预测是基于结构的药物发现的核心，然而在现实的交叉对接条件下，基于物理的方法和人工智能驱动方法的相对性能仍未得到充分表征。在此，研究人员比较了基于物
交叉对接与重对接揭示基于物理和人工智能驱动的蛋白质-配体复合物结合姿态预测中成功的不同决定因素
蛋白质-配体姿态预测是基于结构的药物发现的核心，然而在现实的交叉对接条件下，基于物理的方法和人工智能驱动方法的相对性能仍未得到充分表征。在此，研究人员比较了基于物理的对接方法（AutoDock4、AutoDock Vina和DOCK 6）与数据驱动方法，包括深度学习模型GNINA 1.3以及基于扩散的框架AlphaFold 3、Boltz-2和DiffDock。使用标准化的重对接和交叉对接方案，针对代表不同结合位点架构的三种阿尔茨海默病靶标进行了性能评估：乙酰胆碱酯酶（AChE；深峡谷）、β-分泌酶1（BACE1；柔性瓣控制位点）和糖原合酶激酶-3β（GSK-3β；开放、溶剂暴露口袋）。基于物理的方法在重对接期间具有竞争力，但在交叉对接下表现出显著性能下降，而基于扩散的方法通常保持较高的交叉对接精度。GNINA 1.3刚性对接在重对接期间的最低重原子RMSD成功率为87.7%，在交叉对接期间降至13.5%，而AlphaFold 3、Boltz-2和DiffDock的交叉对接成功率分别为93.1%、89.6%和85.7%。AlphaFold 3尽管训练集较小，但始终优于Boltz-2，表明预测性能不仅受训练数据量的影响，还受模型架构和置信度校准等因素的影响。训练重叠分析进一步表明，即使对于训练数据中已表示的复合物，基于AI的方法仍保留显著的失败率，表明训练数据重叠本身并不能确保可靠的姿态预测。在当前方案条件下，刚性对接优于柔性方案，而柔性对接口袋体积相对于实验全息结构表现出更受限的采样。在GNINA 1.3配置中，带有细化的CNN重新打分在交叉对接中产生了最高的姿态恢复成功率，其次是单独的CNN重新打分和默认的Vina/经验打分方法。受体构象偏好依赖于靶标：全息结构为AChE和BACE1提供了更高的对接精度，其配体结合腔表现出更大的结构复杂性和几何限制，有利于姿态区分，而GSK-3β的 apo 结构包含更大、更溶剂暴露的腔，改善了配体可及性和对接性能。总体而言，这些发现证明了交叉对接和训练重叠感知评估对于在现实条件下评估对接性能的重要性，并为基于结构的药物发现中选择对接策略提供了基于腔拓扑的考虑因素。
论文解读：蛋白质-配体结合姿态预测的交叉对接与重对接基准研究
**研究背景与问题**
蛋白质-配体相互作用（protein–ligand interaction，PLI）预测是基于结构的药物发现（structure-based drug discovery，SBDD）的核心环节。然而，准确预测配体结合姿态长期面临挑战，尤其是对于具有显著结构柔性或配体诱导构象变化的靶标。传统基于物理的对接方法，如AutoDock4、AutoDock Vina和DOCK 6，依赖网格化打分函数与启发式搜索算法，通常采用刚性受体表示，隐含假设结合位点静止不变，这可能导致预测偏向晶体学结合模式，并掩盖由受体柔性、交叉对接或配体诱导契合引起的失败。近年来，数据驱动方法如扩散模型AlphaFold 3、Boltz-2、DiffDock以及深度学习工具GNINA 1.3，通过学习大型结构数据集中的蛋白质-配体相互作用模式，在姿态排序和盲对接方面展现出潜力。然而，这些模型能否在真正新颖的蛋白质-配体系统中泛化尚不清楚。现有基准多采用重对接（redocking）评估，即将配体放回其同源受体构象中，这可能高估真实世界性能。相比之下，交叉对接（cross-docking）中受体和配体构象均不同于实验参考，构成更严格的测试。此外，AlphaFold 3与新一代框架Boltz-2之间缺乏标准化比较，结合位点架构对各类方法性能的影响也未得到系统评估。为此，研究人员选取三种阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）相关靶标——乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、β-分泌酶1（β-secretase 1，BACE1）和糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）——它们分别代表深窄峡谷、瓣调控部分封闭腔和开放溶剂暴露口袋三种不同结合位点架构，开展系统基准研究。
**研究设计与主要方法**
研究人员从RCSB蛋白质数据银行（PDB）获取了74个AChE、431个BACE1和107个GSK-3β蛋白质-配体复合物结构。使用UCSF Chimera进行结构比对，删除非受体实体（如晶体水、离子等）。对于交叉对接，每个靶标依据最高X射线衍射分辨率和最少缺失残基标准，选取一个全息（holo）和一个 apo 受体结构：AChE（holo：4M0E，1.55 ?；apo：5HF5，2.30 ?），BACE1（holo：7MYI，1.95 ?；apo：3TPJ，2.00 ?），GSK-3β（holo：1J1B，2.20 ?；apo：1I09，2.30 ?）。配体经SMILES转换并用RDKit再生，以消除对原始晶体构象的依赖。对接方法包括基于物理的AutoDock4、AutoDock Vina、DOCK 6，深度学习GNINA 1.3，以及扩散模型AlphaFold 3、Boltz-2和DiffDock。采用刚性对接和柔性对接（最多6–7个柔性残基）两种方案。评估指标为重原子均方根偏差（heavy-atom root mean square deviation，HA-RMSD）和质心均方根偏差（center of mass RMSD，COM RMSD），成功标准为HA-RMSD ≤ 2 ?。还使用LigBuilder V3计算空腔体积，并评估训练数据重叠对深度学习方法性能的影响。统计方法包括配对Wilcoxon符号秩检验、McNemar检验和Holm校正。
**研究结果**
**交叉对接分析及受体构象对对接精度的影响**
交叉对接结果显示，受体构象状态显著影响对接性能。对于AChE和BACE1，holo结构比apo结构产生更高的姿态恢复率；而GSK-3β则相反，apo结构表现更好。空腔分析表明，AChE的holo结构（4M0E）具有较小但高度复杂的腔（941.75 ?3），其深峡谷和多亚口袋有利于选择性配体识别；BACE1的holo结构（7MYI）空腔较大（2334.63 ?3），部分封闭几何提供紧密配体限制；GSK-3β的apo结构（1I09）具有扩大且溶剂暴露的口袋（1886.63 ?3），减少了几何约束，从而改善配体可及性。因此，受体腔架构而非受体状态本身是对接成功的主要决定因素。基于深度学习的AlphaFold 3和Boltz-2在所有靶标中均优于基于物理的对接方法，其中AlphaFold 3在最佳姿态排序方面表现最佳，表明其置信度校准与结构准确性对齐良好。
**CNN打分与经验打分在交叉对接姿态选择中的评估**
使用BACE1 holo受体（7MYI）评估GNINA 1.3的三种配置：经验Vina打分、CNN重新打分、CNN重新打分加细化。结果显示，CNN重新打分和细化逐步提高了性能，最佳姿态成功率从2%升至4%和9%，最小HA-RMSD成功率从7%升至11%和15%。然而，最佳姿态与最小HA-RMSD成功率之间的差距保持稳定（约5–7个百分点），表明CNN引导的细化主要改善姿态生成质量，而非排序精度。在交叉对接导致的受体扰动下，主要限制是姿态区分而非构象采样。
**DiffDock重对接与交叉对接分析**
DiffDock在重对接中的姿态预测精度高于交叉对接，Top-1预测差异最为明显。例如，GSK-3β重对接最佳姿态成功率为83%，交叉对接holo为66%、apo为77%。对97个含≥10个可旋转键的BACE1配体进行随机ETKDG初始化的敏感性分析显示，多数配体对起始构象不敏感，仅少数高柔性化合物受影响，表明交叉对接性能下降主要源于受体构象变化而非随机初始化。考虑十个预测中的最佳姿态可缩小重对接与交叉对接之间的差距，说明近天然姿态仍可被采样，但排序可能不佳。
**重对接分析**
重对接结果确认刚性对接方案总体一致且可靠。GNINA 1.3（刚性）在三个靶标中均实现>50%的COM RMSD准确率，AutoDock Vina在AChE中达标。柔性对接表现出更大变异性和较低姿态恢复精度，尽管COM RMSD显示姿态常位于正确口袋内。柔性对接产生的口袋体积分布窄且呈近似高斯分布，而实验holo结构分布更宽，表明受限侧链采样稳定了单一主导口袋状态，低估了结合位点的固有柔性。AutoDock4在高柔性配体下更易出现异常高结合能，而相同输入在AutoDock Vina中未产生类似异常，支持其为柔性受体采样的伪影。
**配体尺寸归一化COM分析**
HA-RMSD与COM RMSD呈强正相关（Pearson r = 0.93，Spearman ρ = 0.92）。通过将COM RMSD除以配体回转半径获得尺寸无关指标。局部扭转偏差姿态（HA-RMSD > 2 ?且COM RMSD < 2 ?）的归一化COM RMSD显著低于全局结合位点位移姿态（Mann–Whitney U检验，p < 10?1?）。第95百分位值0.52被作为区分局部扭转重排与真实结合位点错位的经验阈值。
**对接与结构预测性能的统计验证**
配对非参数分析表明，重对接中GNINA 1.3（刚性）在基于物理的方法中表现最强，最低能量姿态选择成功率为73.2%，最小HA-RMSD姿态为87.7%。但在交叉对接中，其成功率骤降至5.5%。AutoDock Vina（刚性）从41.1%降至5.4%，DOCK 6失败运行从4.3%增至43.5%。相比之下，AlphaFold 3交叉对接成功率为90.0%，Boltz-2为82.3%，DiffDock为72.9%，均显著优于所有基于物理的工具。这证明基于物理的方法高度依赖与天然态匹配的结合位点构象，而学习方法在替代构象下保持较高成功率。
**深度学习模型中的结构记忆评估**
训练重叠分析显示，尽管AlphaFold 3、Boltz-2和DiffDock的训练数据覆盖了大部分基准复合物，但失败率仍不可忽视。例如，AChE中AlphaFold 3的最佳姿态失败率为43.75%，Boltz-2为54.54%；BACE1中分别为8.52%和16.02%；GSK-3β中AlphaFold 3仅为7.2%。AlphaFold 3正确预测了多个训练集外的复合物，表明其具备真实结构泛化能力。AlphaFold 3在训练集更小的情况下仍优于Boltz-2，说明模型架构和置信度校准比训练数据量更重要。
**交叉对接条件下DiffDock与GNINA 1.3的分布外泛化**
交叉对接代表分布外（out-of-distribution，OOD）预测问题。GNINA 1.3在交叉对接中表现显著恶化，AChE的Best_Pose_HA-RMSD失败率达100%，BACE1为91%，GSK-3β为95.23%。DiffDock相对稳健，相应失败率分别为20%、20.62%和16.67%。但DiffDock仍表现出一定OOD退化，表明受体构象失配是误差的重要来源。这凸显了在真实受体柔性场景下评估对接方法的必要性。
**训练数据案例的统计分析**
在共同交叉对接条件下，最小HA-RMSD准则下AlphaFold 3获得最低平均HA-RMSD（0.76 ± 1.25 ?，成功率92.1%），其次为Boltz-2（1.07 ± 1.59 ?，89.5%）、DiffDock（1.26 ± 1.39 ?，93.5%）和GNINA 1.3（刚性）（3.97 ± 2.56 ?，13.6%）。配对Wilcoxon检验显示所有交叉对接配对比较均显著（Holm校正后p < 0.05），McNemar检验仅涉及GNINA 1.3的比较显著。DiffDock对受体构象的稳健性远高于GNINA 1.3。
**讨论与结论**
讨论部分指出，受体构象偏好高度依赖于结合位点拓扑。封闭型口袋（如AChE峡谷和BACE1瓣口袋）通常需要holo结构，而溶剂可及性高的GSK-3β口袋在apo构象下表现更好。柔性对接未带来一致性改进，受限于有限侧链采样范围和固定主链。研究局限包括仅使用单一apo和holo结构，以及去除晶体水和离子可能降低生物真实性。未来方向是开发AI与物理混合工作流，利用AI生成姿态，结合物理打分或自由能计算提高亲和力预测。
研究结论强调：对接性能由受体几何、结合位点架构、模型设计和打分策略共同决定，而非单纯训练数据暴露。AI方法在应对受体和配体变异性方面具有优势，但结构泛化和姿态排序仍存在挑战。受体构象是成功的关键决定因素，虚拟筛选前应重视受体选择。在当前有限侧链柔性方案下，刚性优于柔性，表明精确处理受体柔性仍是重大挑战。该研究建立了将对接性能与结构变异联系起来的综合基准框架，为评估下一代对接方法提供了基础。该论文发表在《RSC Advances》上，为药物发现中对接策略的选择提供了基于腔拓扑的实用指导。
