洛神花（Hibiscus sabdariffa L.）与石榴（Punica granatum L.）低共熔提取物对三阴性乳腺癌细胞活力的影响

《Journal of Agriculture and Food Research》：Effect of Hibiscus sabdariffa L. and Punica granatum L. deep eutectic extracts on viability of triple-negative breast cancer cells.

　　

多酚是存在于植物及其副产物中的植物化学物质。为将其用作功能性补充剂，应使用无毒溶剂进行提取。本研究评估了基于氯化胆碱（ChCl）的低共熔溶剂（DESs）与有机酸、多元醇或 carbamides（尿素类化合物）组合对石榴皮和洛神花（玫瑰茄）的提取效果。石榴的DES 1和DES 3提取物的色谱分析显示，安石榴苷（punicalagin）为主要化合物。此外，使用DES 3制备的洛神花提取物呈现出特征性的花青素（anthocyanins）和一些酚酸。对于石榴皮，DES 1和DES 3提取物的提取率与水醇提取物相当。对于洛神花，水醇体系提取效率最高，其次为DES 3。在生物学评价中，DESs提取物对三阴性乳腺癌细胞（TNBCc）的活力表现出显著的剂量依赖性抑制效应。DES 3提取物（石榴皮和洛神花）的半数抑制浓度（IC₅₀）分别为0.21和0.87 mg/mL；DES 1提取物分别为0.28和0.66 mg/mL。选择性指数（SI）表明，来自石榴皮的DES 1、DES 3和水醇提取物具有高选择性，而洛神花DES 1提取物的选择性较低。最后，与未处理细胞相比，TNBCc在提取物处理后出现了形态学改变。研究人员的研究表明，使用DESs从石榴和洛神花中提取多酚类化合物，其提取效率与传统溶剂相当。此外，在体外评价中，该提取物能促进非癌细胞增殖，并选择性降低三阴性乳腺癌细胞的活力。

**论文解读：基于低共熔溶剂提取的石榴皮与洛神花多酚对三阴性乳腺癌细胞活力的影响**

**一、研究背景与目的**

植物及其农工业副产物富含多酚类植物化学物质，具有作为功能性食品补充剂或辅助治疗制剂的潜力。获取这些植物化学物质的首要步骤传统上依赖溶剂提取。然而，使用某些有机溶剂获得的提取物在作为疾病补充治疗剂时，可能引起残留毒性。因此，开发环境友好型的提取程序日益受到重视。低共熔溶剂（deep eutectic solvents, DESs）作为一种绿色替代溶剂受到广泛关注，其由廉价、绿色、低毒或无毒的组分混合而成，各组分可通过氢键相互作用缔合。常见的DESs类型（如Type III）由季铵盐（作为氢键受体，HBA）与多种氢键供体（HBD，如金属氯化物、酰胺、羧酸或多元醇）组成。

石榴（*Punica granatum* L.）和洛神花（*Hibiscus sabdariffa* L.）是常见的功能性食品原料，其功能特性归因于其丰富的酚类化合物。石榴皮中富含酚酸、可水解鞣质及黄酮类化合物，其中安石榴苷（punicalagin）含量丰富，对其生物活性具有重要影响。洛神花的主要成分为花青素、有机酸、黄酮和酚酸。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）因缺乏雌激素、孕激素及HER2受体，患者无法受益于靶向治疗，传统化疗是迄今唯一选择。探索能更选择性抑制癌细胞生长、减少化疗毒副作用的天然化合物成为研究热点。本研究旨在评估：a) 使用DESs提取石榴皮和洛神花多酚的效率并与传统溶剂体系比较；b) 表征低共熔提取物的多酚组成；c) 体外评估多酚提取物对TNBC细胞活力的影响。

**二、研究设计与关键方法**

研究人员制备了三种低共熔溶剂：DES 1（专利申请号No. 206475，IMPI）为含一种carbamide和一种多元醇作为HBD的二元/三元体系；DES 2由氯化胆碱与草酸（OxAc）以1:1摩尔比配制；DES 3由氯化胆碱与苹果酸（MaAc）以1.5:1摩尔比配制（Cvjetko Bubalo et al., 2016），其中DES 2和DES 3添加了25% v/v去离子水作为共溶剂。同时制备了石榴皮（20% v/v乙醇）和洛神花（80:20乙醇-酸化水）的水醇提取物以及酸化水提取物作为对照体系，均在超声辅助下提取。

主要分析技术包括：采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC-DAD）对多酚进行定性和定量分析（分别以280、378和520 nm检测）；采用Folin-Ciocalteau（F-C）比色法测定总多酚含量（TPC）；采用外部标准法对安石榴苷进行定量。生物学评价方面，以人三阴性乳腺癌细胞系Hs 578T（HTB-126，美国典型培养物保藏中心，ATCC）作为靶细胞，以小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3作为非癌性对照细胞系，均购自ATCC。通过MTT比色法评估不同浓度提取物（0.1至1.0 mg GAE/mL）在不同时间（24、48小时）的细胞活力影响，计算半数抑制浓度（IC₅₀）和选择性指数（SI）。采用共聚焦荧光显微镜（Zeiss LMS-700）结合Phalloidin-Atto 488（标记肌动蛋白）和Hoechst 33342（标记细胞核）染色观察细胞形态学改变。

**三、主要研究结果**

**3.1 石榴皮和洛神花提取物的总多酚含量**

采用F-C法测定时，石榴皮提取物在DES 3体系中提取效率最高，水醇体系和DES 1体系提取率相近，水相体系效率最低。然而，研究发现DESs提取物存在浊度现象，可能干扰F-C法的分光光度检测，导致数据高估或变异较大。为此，研究人员补充了HPLC-DAD定量分析：石榴皮提取物在水醇体系中TPC最高（133 ± 1 GAE mg/g），DES 1和DES 3提取率相近（100 ± 1和101 ± 1 GAE mg/g），水相体系最低（71 ± 1 GAE mg/g）。安石榴苷含量方面，DES 1和DES 3提取率（36 ± 1和37 ± 1 mg/g）与传统溶剂（水相44.2 ± 0.4、水醇44.4 ± 0.2 mg/g）存在显著差异。洛神花提取物在水醇体系中TPC最高（252 ± 3 GAE mg/g），DES 3体系（79 ± 2 GAE mg/g）与去离子水体系（82 ± 2 GAE mg/g）接近，DES 1和DES 2体系效率最低。研究还发现，添加25%水可降低DES体系的粘度而不影响组分的分子间相互作用，有利于提取效率的提升。此外，DES 3体系作为酸性混合物，有利于保持花青素的flavylium形式并促进极性酚类化合物的提取。

**3.2 洛神花和石榴皮提取物的色谱特征**

HPLC定性分析显示：洛神花DES 3提取物在520 nm波长下呈现两种主要花青素——飞燕草素-3-桑布双糖苷和矢车菊素-3-桑布双糖苷；在280 nm下可见特征性的酚酸和有机酸。值得注意的是，石榴皮DES 1和DES 3提取物在378和280 nm下主要检测到安石榴苷的β-异构体信号，而非传统溶剂提取物中常见的α/β两种异构体峰。这一现象提示研究的DES体系可能对β-安石榴苷具有选择性分离能力，其分子机制有待进一步研究。

**3.3 低共熔提取物对非癌细胞和TNBC细胞活力的影响**

在非癌性NIH/3T3细胞中，洛神花DES提取物（DES 1和DES 3）在最高剂量（1.0 mg GAE/mL）下孵育48小时后使细胞群分别减少37.4%和41.2%-55.2%，显示出一定的细胞毒性。相比之下，石榴皮DES 1提取物在同样条件下反而使成纤维细胞群增加了5.6%-14.6%，研究将其归因于DES 1组分（ChCl和甘油）可被细胞代谢利用，从而促进细胞活力。

对TNBC Hs 578T细胞而言，所有低共熔提取物均表现出剂量依赖性的细胞活力抑制作用。孵育48小时后：洛神花DES 1提取物在0.1至1.0 mg GAE/mL剂量范围内使细胞群减少35.1%-52.6%；洛神花DES 3提取物使细胞群减少39.3%-51.7%；石榴皮DES 1提取物使细胞群减少45.1%-67.7%；石榴皮DES 3提取物使细胞群减少46.7%-70.3%。在排除DESs溶剂本身（0.15% v/v）对细胞活力无显著影响后，提取物的细胞毒效应被归因于其植物化学多样性。

IC₅₀值计算显示：洛神花DES 1和DES 3提取物对Hs 578T细胞的IC₅₀分别为0.66和0.87 mg GAE/mL，石榴皮DES 1和DES 3则分别为0.28和0.21 mg GAE/mL。选择性指数（SI）评估表明，石榴皮DES 1和DES 3提取物具有极高的选择性（SI值为148.85和171.42），远高于水醇提取物（15.24）；洛神花水醇提取物的SI为1.94，DES 1为4.69（低毒性），而洛神花DES 3提取物的SI为0.57，提示其对正常细胞具有较高毒性。

**3.4 低共熔提取物引起的乳腺癌细胞形态学改变**

共聚焦荧光显微镜观察显示，经IC₅₀浓度提取物处理48小时后，Hs 578T细胞出现多种形态学改变：石榴皮DES 1和DES 3提取物引起细胞萎缩（48%和46%）、结构损伤（19%和38%）、巨大细胞形成（3%和11%）以及肌动蛋白细胞骨架解聚（68%和58%）；洛神花DES 3提取物处理导致细胞结构损伤（49%）、巨大细胞（49%）、肌动蛋白解聚（46%）以及细胞核和细胞质体积增大、核颗粒化，同时细胞失去特征性的星形形态。所有处理组的细胞密度均明显低于未处理对照组，进一步验证了提取物的抗增殖效应。

**四、讨论与结论**

研究表明，ChCl基DESs（与多元醇、carbamide或有机酸结合，辅以水作为共溶剂）在石榴皮和洛神花多酚提取方面取得了与传统溶剂体系相当的提取效率。在体外评价中，这些低共熔提取物不仅能促进非癌细胞的增殖，还能选择性降低三阴性乳腺癌细胞的活力和增殖能力。值得注意的是，石榴皮DES 3提取物对TNBC细胞表现出极高的选择性（SI = 171.42，IC₅₀ = 0.21 mg GAE/mL），是本研究中最具前景的治疗候选体系。这些发现为开发利用低毒、环境友好的DESs体系提取功能性食品来源的多酚类化合物，并将其作为TNBC辅助治疗手段提供了重要的科学依据。论文发表在《Journal of Agriculture and Food Research》。