《Nature Biomedical Engineering》：Sequence and structural determinants of efficacious de novo chimaeric antigen receptors
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人工智能（AI）驱动的蛋白生成设计已能快速开发针对异质性靶点（包括肿瘤相关抗原）的结合物。尽管已有大量生化表征，这些新型蛋白结合物在包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞在内的候选疗法中评估仍有限。研究人员综合生成式蛋白设计流程，筛选1758个靶向BCMA、CD19
人工智能（AI）驱动的蛋白生成设计已能快速开发针对异质性靶点（包括肿瘤相关抗原）的结合物。尽管已有大量生化表征，这些新型蛋白结合物在包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞在内的候选疗法中评估仍有限。研究人员综合生成式蛋白设计流程，筛选1758个靶向BCMA、CD19和CD22的新设计蛋白结合物，在可规模化蛋白结合、T细胞活化和体内杀伤实验中评估疗效。研究人员界定了阻碍从头蛋白结合物用作CAR的三大挑战：本底信号（tonic signalling）、表位占据受阻（occluded epitope engagement）和脱靶活性（off-target activity）。研究人员建立计算与实验启发式方法克服这些限制，包括对单个亲本结构序列变体筛选，在保留靶向CAR活化的同时降低风险。该框架加速AI设计蛋白用于未来临床前治疗筛选，助推新一代细胞疗法。
研究背景方面，嵌合抗原受体（CAR）是重定向免疫细胞攻击癌症与自身免疫病相关病原细胞的合成蛋白，目前已获批的CAR多沿用单链抗体片段（scFv）识别抗原。然而scFv存在聚集导致本底信号、表位选择受限等问题。人工智能（AI）驱动的从头蛋白结合物具有体积小、可预设表位、折叠稳定等优势，但在CAR中的系统评估不足。因此，研究人员在《Nature Biomedical Engineering》发表该研究，综合生成式蛋白设计流程，对1758个靶向BCMA、CD19、CD22的从头设计蛋白结合物进行蛋白结合、CAR活化和体内外功能表征，旨在明确高效CAR结合物的序列与结构决定因素。
主要关键技术方法包括：采用RFdiffusion与BindCraft两类生成式设计流程产生候选结合物；以酵母表面展示（YSD）做池化富集与测序；用生物层干涉仪（BLI）确认重组蛋白亲和；以Jurkat细胞与原代人T细胞做CAR活化，读数为CD69；用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析转录状态；构建NSG小鼠异种移植模型做体内肿瘤控制；并以CARPNN即CAR-ProteinMPNN流程对亲本结合物做界面与非界面残基多样化，再用Boltz-2过滤。样本包括原代T细胞来自多名健康供者，肿瘤细胞系与NSG小鼠模型。
研究结果如下。从头设计蛋白结合物部分，研究人员用RFdiffusion与BindCraft靶向BCMA，YSD显示BindCraft富集更高，BLI确认亲和力约2至200 nM，证明零样本从头结合物可达临床级亲和力。表征CAR活性部分，在Jurkat与原代CAR T中，17个BindCraft BCMA结合物分为低活化、高本底、高靶向三型，活性增益与可微溶剂可及表面积（dSASA）强相关，B2、B4、B5表现最佳，B5在原代T中诱导细胞因子优于临床scFv C11D5.3。序列变异决定本底信号部分，对B5做CARPNN多样化，发现结合物净电荷与本底信号强相关，scRNA-seq显示进化型B5.I0效应基因IL2、IFNG表达高于亲本。从头CAR的肿瘤控制部分，B5.I0在体外与体内RPMI-8226模型实现持续退瘤，反复刺激后增殖强于C11D5.3；高肿瘤负荷模型中B5.I0在效应细胞比1:10时近完全控瘤，而C11D5.3与cilta-cel所用VHH1-VHH2不能。天然配体造成表位占据部分，CD19设计中多数结合物被导向CD81结合表位，在CD81敲低靶细胞上C1、C2才激活CAR，证明内源CD81遮挡所设计表位。识别与挽救脱靶CAR活性部分，CD22结合物D1在CD22阴性细胞有脱靶活化，CARPNN非界面突变体D1.N0保留靶向活性并降低脱靶，scRNA-seq与体外杀伤证实其特异性。计算属性预测高效CAR设计部分，RFdiffusion产物丙氨酸过多致界面松散，ipSAE高于0.85是跨战役最优过滤指标，NetMHC显示从头结合物免疫原性不高于临床scFv。
讨论与结论部分，研究人员指出从头蛋白结合物用于CAR面临本底信号、表位被内源配体占据、脱靶结合三类限制，但可通过非界面残基工程与计算过滤缓解。结论为：AI设计minibinder可作为CAR抗原识别模块，CARPNN类序列多样化能保留靶向并降低风险，ipSAE可作通用先验指标；该研究为异质抗原的下一代细胞疗法提供路线，未来需结合第二代人CAR以外改造以维持重复刺激后杀伤力。
研究结论翻译：研究人员证明生成式蛋白设计可产生靶向BCMA、CD19、CD22的CAR兼容minibinder；本底信号由结合物净电荷驱动，CD19有效表位被CD81占据，CD22脱靶可由非界面突变挽救；ipSAE≥0.85提升实验成功率。该框架加速AI设计蛋白进入临床前CAR筛选，并为减少CAR风险、增强疗效提供路线图。
