依赖于吡哆醛磷酸（pyridoxal phosphate, PLP）的 tRNA 中 aminovaleramide 的 AvaS 生物合成

《Nature Chemical Biology》：Pyridoxal-phosphate-dependent biosynthesis of aminovaleramide by AvaS in tRNA

　　

在原核生物中，异亮氨酸密码子 AUA 的解码需要一种特化 tRNA（tRNAIle2），其反密码子摆动位置（C34）带有赖西啶（lysidine, k2C），从而将解码特异性从甲硫氨酸（AUG）转换为异亮氨酸（AUA）。近来，aminovaleramide 胞苷（aminovaleramide cytidine, ava2C）在若干细菌和植物的同一 tRNA 位置被发现，并被证明支持 AUA 解码和异亮氨酸特异性氨酰化。然而，催化 ava2C 的酶尚不清楚。研究人员报道，tRNAIle-aminovaleramididine 合成酶（AvaS）在铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA14 中催化 ava2C 生物合成。AvaS 通过依赖于吡哆醛磷酸（pyridoxal phosphate, PLP）的氧化脱羧机制将 k2C 转化为 ava2C，该结论由定点诱变和体外酶学实验支持。双报告基因实验表明，ava2C 修饰的 tRNA 比 k2C 修饰的 tRNA 具有更低的 AUA 解码效率。此外，全基因组筛选揭示了 ava2C 水平与代谢及胁迫响应通路之间的意外联系，这些通路影响 i6A/ms2i6A 动态。这些发现界定了 ava2C 生物合成的分子和其更广泛的细胞代谢网络基础。

研究背景方面，所有生命域的 tRNA 均携带大量转录后修饰，其中反密码子环第 34 位摆动位置修饰对解码保真度至关重要。细菌中 tRNA^Ile2 的 C₃₄ 由 TilS 催化形成 k²C，使 AUA 而非 AUG 被解码；古菌则采用 agmatidine（agm²C）。近来 Suzuki 实验室在部分细菌和植物中发现 ava²C 也可支持 AUA 解码与异亮氨酸充电，但其生物合成酶未知。研究人员此前在铜绿假单胞菌 PA14 转座子插入突变体库的小 RNA 表观转录组筛选中，观察到 PA14_24190 缺失会使一个与 ava²C 同量异位修饰 inm⁵U 的信号消失，因此亟需鉴定该修饰的合成基因与机制。该项工作发表于《Nature Chemical Biology》。

主要关键技术方法包括：基于液相色谱-串联四极杆（LC–QQQ）和高分辨四极杆飞行时间（QTOF）质谱的核糖核苷鉴定；铜绿假单胞菌 PA14 全基因组转座子插入突变体库（5764 株）、大肠杆菌 K12、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）及霍乱弧菌（Vibrio cholerae）样本队列；将 PA14_24190（命名为 avaS）在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白；定点诱变；体外 tRNA 与 PLP 酶促反应；分子对接与结构建模；双报告基因（GFP/mCherry）解码效率测定；序列相似网络（SSN）与系统发育分析；STRING 互作网络与 Gene Ontology（GO）富集分析。

研究结果如下。ava²C is present in PA14, A. baumannii and A. thaliana：研究人员通过 LC–QQQ 与合成标准品共洗脱、高分辨 MS/MS 碎片比对，确认 PA14 小 RNA 中 N³⁴¹ 为 ava²C，并在鲍曼不动杆菌与拟南芥花、根、叶、苗中检出 ava²C，同时 k²C 水平很低，提示产物-前体关系。PA14 AvaS is involved in ava²C biosynthesis：PA14_24190 缺失使 ava²C 消失、k²C 积累；该基因在大肠杆菌 K12 中表达后 k²C 降低逾 90% 并产生 ava²C；核糖核苷分析显示 ava²C 与 k²C 均特异存在于 tRNA^Ile2，而非 tRNA^Met、tRNA^fMet 或 tRNA^Ile。AvaS catalyzes PLP-dependent formation of ava²C from k²C：PLP 合成基因 epd、pdxJ、pdxA、pdxB 敲除导致 ava²C 下降与 k²C 积累；AlphaFold 结构模型与 AcdS 比对显示 AvaS 属折叠类型 II PLP 依赖酶，活性口袋围绕 C₃₄、A₃₅、t⁶A₃₇；K43、K46、N71、D208、Y265 等丙氨酸替代完全失活，E262A 部分失活；纯化物在 tRNA 加 PLP 条件下将 k²C 转为 ava²C，缺 AvaS 或 PLP 无产物。ava²C-tRNA^Ile2 decodes AUA less efficiently than k²C：在 PA14 与大肠杆菌双报告系统中，tRNA^Ile2 带 ava²C₃₄ 时 GFP/mCherry 比约降为 k²C₃₄ 的一半，表明 ava²C 保真度高但解码速度/效率较低。The AvaS proteins are distinct from other DcyD-like proteins：对 AcdS/D-半胱氨酸脱巯基酶（DcyD）家族 24000 余蛋白做 SSN，分五簇；AvaS1（细菌）、AvaS2（细菌与真核）、AvaS3（真核）与 ava²C 生物合成相关，霍乱弧菌 VC_1743 缺失验证其功能；AvaS 具正电荷 tRNA 结合沟及特征残基 E143、T182、T185、F239、G298。AUA codons are rarely used in bacterial genomes：PA14 中 Ile-AUA 仅占异亮氨酸密码子约 3%；AvaS+ 与 AvaS? 基因组每千密码子 AUA 用量差异极小，GSEA 未显示显著 AUA 偏向，说明 ava²C 非静态密码子偏好驱动。Gene network links shared metabolism to ava²C and ms²i⁶A：37 个敲除使 ava²C 降低；分层聚类显示部分株中 ms²i⁶A 降、i⁶A 升；STRING 网络把 PLP 合成、嘧啶合成、RNA 代谢、truB/mnmE/gidA 等连成模块，表明 ava²C 与 i⁶A 家族修饰共享 PLP 与铁硫簇（Fe–S）代谢依赖。

讨论部分总结：研究人员指出 AvaS 是新型 PLP 依赖氧化脱羧酶，把 RNA 修饰酶学从氨基酸底物拓展到 tRNA 碱基修饰。机制上，K43 内希夫碱活化 PLP，k²C 形成外醛亚胺，经醌式中间体、氧进攻、脱羧生成 ava²C；该通路与 AcdS/Cap15 等 PLP 氧化脱羧酶同源。ava²C 不仅是解码修饰，也是代谢-胁迫信号节点：PLP 限制、 stringent response、（p）ppGpp、ROS 与 Fe–S 簇损伤会同步改变 ava²C 与 ms²i⁶A；succinyl-CoA 节点缺失则可上调 ava²C 与 ms²io⁶A。TilS 对 tRNA^Ile2 的严格识别使 k²C 合成成为 ava²C 上游限速步骤；tRNA 成熟因子 cca、pnp、truB 缺失通过耗尽底物或破坏折叠间接降 ava²C。解码上，ava²C 与核糖体解码裂隙刚性适配增强保真度但可能拖慢转位，氨酰化产率则与 k²C 相近。

研究结论部分翻译：研究人员报道了新型 PLP 依赖氧化脱羧酶 AvaS，其催化 tRNA 修饰 ava²C 的合成。通过全基因组小 RNA 修饰筛选、结构鉴定、avaS 遗传鉴定、定点诱变与体外 tRNA/PLP 反应，确立 AvaS 为 PLP 依赖 tRNA 修饰酶。AvaS 与 PLP 依赖氧化脱羧酶共享反应性醌式中间体与氧掺入机制，从而把该类酶的催化范式扩展至 RNA 生物学。全基因组网络显示 ava²C 与 i⁶A/ms²i⁶A 通过 PLP 生物合成、Fe–S 簇稳态、氧化还原与 stringent response 相偶联，提示 ava²C 是条件性调控的表观转录组节点，而非单纯由 AUA 密码子使用偏好决定。ava²C 以更高解码保真度和稳定性换取翻译速度，体现 tRNA 修饰在翻译调控、代谢适应与微生物致病/胁迫响应中的可塑作用。该发现拓展了 PLP 酶功能图谱，并展示高通量表观转录组平台在 RNA 化学生物学发现中的价值。