非经典氧化还原辅因子在自然酶中广泛使用的序列基序

《Nature Chemical Biology》：A sequence motif enables widespread use of noncanonical redox cofactors in natural enzymes

　　

非经典氧化还原辅因子（NRC，noncanonical redox cofactors）是天然氧化还原辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP+）的低成本替代物，可用于生物制造，并提供精细的电子传递控制，但其应用受限于可兼容酶的数量不足。研究人员筛选醛脱氢酶（ALDH，aldehyde dehydrogenase）家族，鉴定出一个保守的 RH/QxxR 基序，该基序使多种天然酶具备 NRC 活性。牛（Bos taurus）ALDH3a1 对烟酰胺单核苷酸（NMN+，nicotinamide mononucleotide）表现出前所未有的催化周转，其 kcat 高于 NAD+，并比多数工程化 NRC 活性酶高 10–105 倍。结构分析显示，该基序不依赖 NAD+ 的腺苷酸单磷酸（AMP，adenosine monophosphate）部分，而是强化辅因子定位并预组织活性位点。该基序支持简单合成 NRC（如 1-(2-carbamoylmethyl)nicotinamide）的活性；导入不同 ALDH 骨架后，NMN+ 活性最高提升 60 倍。这些结果阐明了自然演化对 NRC 活性酶的解决方案，并为挖掘天然酶中潜在进化可塑性、获得更优工程起点提供了蓝图。

《Nature Chemical Biology》发表的该研究围绕非经典氧化还原辅因子（NRC，noncanonical redox cofactors）在生物制造中的应用瓶颈展开。天然氧化还原反应普遍依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD(P)⁺）。在全细胞体系中，NAD(P)⁺会引发副反应、破坏细胞适应度并限制热力学驱动力；在无细胞体系中，即使进行辅因子再生，NAD(P)⁺成本仍然过高。NRC 作为 NAD(P)⁺的仿生类似物可克服上述缺陷，但天然能高效利用 NRC 的酶极为稀缺，而从头工程改造的 NRC 酶催化效率通常比天然 NAD(P)⁺ 活性低若干个数量级。因此，研究人员希望从天然序列空间中直接发掘可利用 NRC 的酶，并提炼其序列与机制规律。

研究人员以醛脱氢酶（ALDH，aldehyde dehydrogenase）蛋白家族为对象，因其序列功能多样且结构同源性强。研究采用设计-构建-测试-学习（DBTL，design-build-test-learn）循环：先基于 ALDH 蛋白家族构建序列相似性网络（SSN，sequence similarity network），从 UniRef50 聚类中挑选代表序列；随后在大肠杆菌中表达并纯化候选 ALDH，利用 WST-1 显色循环法和高通量平台测试其对 NAD⁺与 NMN⁺的活性；进一步通过细化 SSN、多序列比对发现保守基序，采用丙氨酸扫描、晶体学、分子动力学（MD，molecular dynamics）解析机制；并将 RH/QxxR 基序移植到不同 ALDH 骨架上验证可迁移性；最后用苯甲醛转化实验测试多种简单合成 NRC。样本队列来自 ALDH 蛋白家族中不同生物来源的代表序列，包括牛 Bos taurus ALDH3a1（BtALDH3）、Pseudanabaena biceps ALDH（PbALDH）、人 Homo sapiens ALDH3a1（HsALDH3）及 Pseudomonas putida 的 class 3 ALDH（PpMdlD）等。

主要技术方法如下：研究人员首先构建 ALDH 蛋白家族的序列相似性网络（SSN），以 UniRef50 聚类降低序列冗余并选取代表节点；继而用 WST-1 显色循环assay与340 nm分光光度assay高通量评价 NAD⁺和 NMN⁺活性；通过细化 SSN 与多序列比对鉴定 RH/QxxR 基序；利用丙氨酸扫描突变、X 射线晶体学和分子动力学（MD）模拟阐明基序稳定活性位点环区的结构机制；将 RH/QxxR 基序定点移植至不同 ALDH 骨架以检验功能迁移；并合成 BNA⁺、BANA⁺、AmNA⁺等简单合成 NRC，以24 h苯甲醛至苯甲酸转化assay评估底物与辅因子广度。

研究结果部分保留小标题如下。

High-throughput screening of ALDHs for activity toward NMN⁺：研究人员通过 SSN 从 ALDH 蛋白家族选出42个代表酶，在96孔板中用 WST-1 显色循环assay测试。结果显示超过三分之一的 ALDH 对 NMN⁺有活性，其中 BtALDH3 的 NMN⁺活性最高且跨底物稳定，说明 ALDH 家族中天然存在可观的 NRC 利用潜力。

Characterization of NMN⁺-active ALDHs：研究人员测定 BtALDH3 与 PbALDH 的表观动力学参数。BtALDH3 对 NMN⁺的 k_cat为 2.1±0.1 s^?1，高于 NAD⁺的 1.4±0.1 s^?1；PbALDH 对 NMN⁺的 k_cat为 3.02±0.01 s^?1。两株野生型酶 NMN⁺催化效率可达各自 NAD⁺活性的约2%和4%，按相对天然辅因子的效率比计算，优于文献中绝大多数天然或工程酶。

Elucidating the sequence determinant of NMN⁺ activity：研究人员对 BtALDH3 所在子网进行细化 SSN 与多序列比对，发现 R289、Q/H290、R293 构成的 RH/QxxR 基序在该子网保守，且在 ALDH 蛋白家族其他子网中不作为共识序列出现。网外含该基序的 ALDH-155、ALDH-238 也对 NMN⁺有活性，证明该基序是 NMN⁺活性的关键序列决定因素。

Structural mechanism of NMN⁺ use by RH/QxxR motif：研究人员解析 BtALDH3 与 NAD⁺（1.46 ?）、NMN⁺（1.77 ?）复合体及 H290L 变体（1.40 ?）晶体结构，并进行 MD 模拟。NAD⁺与 NMN⁺的 NMN 部分结合构象几乎一致（r.m.s.d. 0.193 ?）。R293 通过氢键和盐桥稳定 E333–G337 环，使 F336 与 W114 形成芳香盖（aromatic lid），包裹 NMN 头部；H290 直接配位 NMN⁺磷酸并支撑 W114。丙氨酸扫描中 R293A 使 NMN⁺活性下降98%，三倍突变更使 NAD⁺与 NMN⁺活性均下降99%。MD 显示三倍突变使 E333–G337 的 Cα r.m.s.f. 由 0.80±0.19 ? 增至 1.12±0.17 ?，说明 RH/QxxR 通过刚性化活性位点、不依赖 AMP 尾部来实现 NRC 利用。

RH/QxxR motif is transferable to diverse ALDHs and NRCs：研究人员将 RH/QxxR 移植到不同进化位置的 ALDH 中，除 ALDH-014 因折叠异常外，多数 NMN⁺活性显著提升，ALDH-037 RHR 的 NMN⁺催化效率提升60倍，主要源于 K_M下降。研究人员还用 BtALDH3、PbALDH、HsALDH3、PpMdlD 测试 BNA⁺、BANA⁺、P2NA⁺、P3NA⁺、P3NA-OMe⁺、AmNA⁺等简单合成 NRC。PbALDH 对 AmNA⁺24 h转化达19.4±0.4 mM（97%），PpMdlD 达14.1±0.2 mM（70%），HsALDH3 也显示较宽 NRC 谱；说明 RH/QxxR 是搜索 ALDH 类 NRC 活性的序列标志，但实际转化速率还受酶自身 k_cat与全局构象动力学影响。

讨论部分总结：研究人员指出，相较既往从单一骨架从头工程化 NRC 酶，本研究系统筛查 ALDH 蛋白家族，发现天然 NMN⁺利用酶 BtALDH3 与 PbALDH 的相对催化效能比多数已报道路线高10¹–10⁵倍。RH/QxxR 基序代表自然演化已形成的辅因子识别可塑性：酶可更强接触烟酰胺“头”，弱依赖 AMP“尾”。该思路可推广到其他氧化还原酶类，用以挖掘天然酶作为 NRC 工程优质起点。

研究结论部分翻译：本工作中，研究人员使用 DBTL 方法，迭代利用天然序列空间来发现并工程化 ALDH 以利用 NMN⁺和简单合成 NRC。此前研究多基于特定骨架从头工程化 NRC 活性；而研究人员系统筛查 ALDH 蛋白家族，鉴定出天然 NMN⁺利用 ALDH。其中，BtALDH3 与 PbALDH 按 NMN⁺催化效率与野生型天然 NAD(P)⁺催化效率之比，比以往所有天然或工程酶高约10¹–10⁵倍，唯一例外是磷酸脱氢酶 PTDH LY13 达到相近水平。RH/QxxR 基序可不依赖 NAD⁺的 AMP 部分而预组织活性位点，并能迁移到不同 ALDH 骨架，提升 NMN⁺及多种简单合成 NRC 活性。该基序可作为在 ALDH 中搜寻超出 NMN⁺的 NRC 依赖活性的序列指标；但转化幅度还由酶催化速率与固有构象动力学决定。自然演化产生的丰富酶骨架库，可被开采以推进 NRC 酶工程。