质膜有序性描绘免疫细胞的功能多样性

《Nature Chemical Biology》：Plasma membrane order maps functional diversity in immune cells

　　

摘要翻译：细胞膜经历生物物理重塑以适应周围环境并执行特定的生物学功能。然而，这些变化在人类免疫细胞中的程度及相关性仍然未知，这主要是因为缺乏单细胞和多维研究方法。研究人员应用一种基于流式细胞术的方法填补了这一空白，将生物物理分析与免疫细胞标志物的同步检测相结合。该平台揭示了免疫细胞中显著且具有细胞类型依赖性的质膜（plasma membrane，PM）有序性异质性。通过依据膜有序性分选免疫细胞，并进行转录组和空间表面蛋白质组分析以及功能性测试，研究人员证明质膜有序性可用于识别具有不同表型和功能行为的免疫细胞亚群。研究结果证明了免疫细胞中质膜有序性存在广泛的异质性，这将基于生物物理特性为健康和疾病状态下免疫细胞状态的更精确定义提供依据。

论文解读文章

细胞膜的生物物理性质，尤其是质膜（plasma membrane，PM）有序性（又称膜流动性），是细胞维持稳态和响应环境变化的重要参数。脂质分子通过复杂动态的相互作用共同决定膜的极性、有序性、黏度和弯曲刚度，这些性质在细胞增殖、迁移等过程中会发生变化。近年来，膜生物物理性质与免疫细胞活性的关系逐渐受到关注，然而，在人类免疫细胞中，膜有序性的变化幅度、细胞类型依赖性及其与功能状态的关联尚不清楚。传统研究方法多限于显微技术，难以实现单细胞水平和高通量同时检测多个免疫细胞亚群。因此，亟需一种能够同时测量多种免疫细胞膜有序性并关联其表型与功能的方法。本研究旨在填补这一空白，通过结合流式细胞术与新型环境敏感型溶剂化显色探针Pro12A，系统分析人类免疫细胞质膜有序性的异质性，并探讨其作为免疫细胞状态新维度的潜力。

研究人员采用基于流式细胞术的方法，利用窄发射光谱的质膜特异性溶剂化显色探针Pro12A，结合多参数免疫细胞表面标志物染色，对健康供者（n=14）、慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL；n=5）患者以及新冠感染后急性后遗症（long COVID，LC；n=14）患者的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）进行单细胞水平质膜有序性测量。通过计算归一化广义极化（normalized generalized polarization，ΔGP）值定量膜有序性（高ΔGP代表高膜有序性）。研究人员进一步依据膜有序性对自然杀伤（natural killer，NK）细胞进行生物物理分选，分离出低膜有序性（NK-L）和高膜有序性（NK-H）亚群，并进行转录组分析、空间表面蛋白质组分析（proximity network analysis，PNA）及迁移和杀伤功能实验。主要技术方法包括：流式细胞术结合Pro12A探针检测膜有序性；基于膜有序性的流式分选；RNA测序和DESeq2差异表达分析；基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）；PNA分析表面蛋白丰度、聚集及共定位；趋化迁移实验和细胞毒性脱颗粒实验。样本来源包括健康供者、CLL患者和LC患者的PBMCs。

研究结果部分：

**免疫细胞质膜有序性可区分疾病状态**。通过比较健康供者、LC患者和CLL患者的PBMCs整体ΔGP值，发现LC患者整体PM发生僵化（即ΔGP升高），而CLL患者无此整体效应。进一步亚型分析显示，不同免疫细胞亚群的膜有序性变化具有细胞类型特异性，单核细胞来源树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells，Mo-DCs）和树突状细胞（dendritic cells，DCs）在疾病状态下膜有序性系统性增加，而NK细胞和T细胞亚群的变化相对较小。

**质膜有序性在不同免疫细胞亚型间存在差异**。通过统一流形逼近与投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）聚类12种免疫细胞亚群，发现每类细胞具有独特的ΔGP分布模式。例如，细胞毒性T细胞和NK细胞呈单峰分布，而树突状细胞和B细胞呈多峰分布。在所有细胞中，ΔGP值可划分为高、中、低三个群体；低ΔGP群体对应死细胞。将ΔGP作为额外维度纳入UMAP分析，可提高具有相似表面标志物但功能不同的细胞亚群的分辨率，例如NK样细胞毒性T细胞。

**中等质膜有序性定义一种独特的细胞状态**。通过膜联蛋白V（annexin V，AnV）和活力染料染色，发现中等ΔGP群体并非凋亡细胞，而是具有完整膜完整性但膜有序性较低的可活细胞。光谱共聚焦显微镜证实中等ΔGP细胞无Pro12A内化现象，且AnV呈点状积聚，提示这类细胞可能处于一种不同于高ΔGP池的生理状态，例如与膜不对称性部分破坏或细胞活化相关的状态。

**质膜有序性与表面标志物正交**。ΔGP与大多数细胞表面生物标志物的相关性具有细胞类型和样本依赖性，未发现普遍规律。例如在CD8+ NK细胞中，ΔGP与CD11c呈负相关，而在CD56dim NK细胞中则呈正相关。这表明膜有序性可作为独立于表面标志物的额外维度，反映复杂的表面表型和动态细胞状态。

**基于质膜有序性的生物物理分选**。研究人员建立了仅基于ΔGP的NK细胞分选方法，收集ΔGP低于第15百分位数（NK-L）和高于第85百分位数（NK-H）的细胞。经24小时恢复培养后，两种细胞的ΔGP均趋近于中间值，但功能差异仍然存在。

**较低质膜有序性与更快的NK细胞迁移相关**。在ICAM1包被表面上经CXCL12趋化因子梯度诱导，NK-L细胞迁移速度显著快于NK-H细胞（平均约快25%）。尽管供体间存在差异，但每个供体均呈现一致趋势。由于恢复培养后ΔGP差异消失，表明膜有序性可能是细胞状态的选择指标而非迁移的直接决定因素。

**高质膜有序性NK细胞具有更强的杀伤效率**。NK-H细胞与K562肿瘤细胞共孵育后，杀伤的肿瘤细胞数量多约10%，NK细胞存活率高约24%；脱颗粒细胞频率增高28%，CD107a平均信号强度增高20%。NK-H细胞主要为CD56dim亚群，而NK-L包含更多CD56bright细胞，提示膜有序性分选富集了不同成熟或功能状态的NK细胞。

**高质膜有序性NK细胞免疫抑制减轻**。转录组分析显示，NK-H与NK-L之间有261个基因显著下调和37个基因显著上调。NK-H中上调基因涉及应激反应和膜动力学，下调基因富集于细胞周期、细胞因子信号和趋化性等通路。在NK-H中，TGFβ信号通路的负调节因子（如BAMBI、TGIF1、CITED2、ID1）显著上调，提示NK-H细胞的增强杀伤力可能与抑制TGFβ介导的免疫抑制有关。

**NK-L呈更具增殖性、细胞毒性较低的表型**。NK-L细胞显著高表达CDK1、CDC25C、BACH2、BIRC5、CCR7和CD36等基因，这些基因与增殖、未成熟NK细胞表型及迁移增强相关。未观察到耗竭标志物的显著变化。

**NK-H呈IL依赖性促炎表型**。NK-H细胞显著下调IL1R2、IL1RN和IRAK3等编码IL-1炎症通路抑制因子的基因，以及对NK细胞毒性有负调控作用的IL6R，而CXCL8也下调。这提示高膜有序性NK细胞可能对IL-1介导的炎症更敏感。

**质膜有序性反映NK细胞的成熟度和细胞毒性**。PNA分析显示，NK-H富集于以CD16、CD57、KIR高表达为特征的成熟NK细胞簇，并高表达CD16、CX3CR1、KLRG1和Siglec7/9等终末分化标志；而NK-L富集于CD56high、NKG2A、CD27等未成熟表型，并高表达HLA-DR/DP/DQ、HLA-ABC、CD58、CD48等激活和黏附相关分子。

**静息培养保留NK-H和NK-L的表型差异**。24小时恢复培养后，两种亚群的膜有序性趋同，但PNA显示两者在培养诱导的表面蛋白重塑方面相似，而基线时存在的成熟度和功能相关表型差异仍然存在。

**生物物理分选揭示NK细胞异质性**。在CD56dimCD16pos经典成熟细胞毒亚群中，NK-H和NK-L细胞仍呈现不同的表面蛋白丰度和空间组织，例如NK-H中抑制性分子CD48、CD52、CD47更低，而CD162和CD49d更高。

**NK-H和NK-L在表面蛋白网络方面存在差异**。PNA差异邻近分析显示，高膜有序性与ADAM10与四旋蛋白（CD37、CD53、CD81）邻近性降低相关，同时CD53与CD162的邻近性降低、与CD48的邻近性升高。这些空间组织差异并不伴随丰度改变，表明膜有序性可能通过影响表面蛋白网络来指示NK细胞的功能潜力。

讨论与结论总结：本研究表明，质膜有序性是一种能够反映免疫细胞状态和功能潜力的生物物理参数。研究人员开发的方法将多参数流式细胞术与生物物理分选相结合，在单细胞水平量化了PBMCs中多种免疫细胞的膜有序性，并揭示了疾病状态下免疫细胞膜有序性的细胞类型依赖性重塑。基于膜有序性的NK细胞分选鉴定出具有不同迁移能力、杀伤效率、转录程序和表面蛋白网络的细胞状态。尽管培养后膜有序性趋同，但功能表型差异保留，说明膜有序性反映了更深层的细胞调控状态。该平台与标准商业化流式细胞仪兼容，可扩展至其他生物物理维度，有望整合到常规免疫表型分析和诊断流程中，为免疫状态评估提供新的正交参数。研究结论强调，质膜有序性是一个适应性的生物物理变量，由内在程序和外部信号共同塑造，可作为病理状态替代标志物和免疫细胞功能状态的补充指标。