人类内耳发育的单核转录组图谱

《Nature Neuroscience》：A single-nucleus transcriptomic atlas of human inner ear development

　　

摘要
听觉和平衡依赖于多种内耳细胞类型的协调活动，然而调控这些细胞在人类中发育和特化的机制仍不清楚。因此，这限制了对疾病基因如何影响细胞类型形成和功能的理解，也限制了靶向治疗（包括基因治疗）的开发。研究人员呈现了人类内耳发育单核RNA测序图谱（Human Inner Ear Development snRNA-seq Atlas，HIEDRA），这是一个涵盖第一和第二孕期的人类内耳单核转录组图谱。HIEDRA绘制了感觉性和非感觉性上皮、神经元以及间充质相关群体的图谱，包括对离子稳态至关重要的尚未充分表征的分泌细胞。研究人员发现有感觉和分泌谱系对疾病相关基因具有选择性易感性，推断出调控网络，并表明Hedgehog信号抑制是分泌细胞特化所必需的。研究人员在人类内耳类器官中验证了这一机制，将该模型扩展至包含所有主要细胞类型。总之，这些发现为人类内耳细胞类型特化提供了见解，改进了体外模型，并将HIEDRA建立为研究人类内耳发育的资源。

**人类内耳发育的单核转录组图谱：细胞特化、疾病关联与类器官验证**

**研究背景与目的**
听力与平衡障碍影响全球约5%的人口，新兴的基因治疗旨在纠正遗传性耳聋的潜在生物学缺陷，但其成功依赖于三个关键认知：哪些人类内耳细胞类型表达致病基因、这些细胞在发育中如何产生和分化，以及其调控程序能否被调节。目前，已知的150多个耳聋相关基因在人类细胞类型中的表达尚未被完整绘制，动物模型的发育通路存在物种差异，且缺乏识别人类内耳细胞命运调控程序的框架。单细胞转录组技术已在皮肤等器官中推动了发育与疾病研究，但内耳领域的大多数单细胞研究集中于小鼠耳蜗，人类内耳发育及耳蜗与前庭区域的区分仍不明确。此外，人类多能干细胞（hPS细胞）来源的内耳类器官虽能模拟部分感觉结构，却缺少对正常功能至关重要的分泌细胞等关键类型。为此，研究人员建立了人类内耳发育单核转录组图谱HIEDRA，旨在系统解析细胞类型特化、疾病基因易感性及发育调控机制，并据此改进体外模型。

**研究内容与主要发现**
研究人员收集了9例胎龄7至15周（FW7–15）的人类胎儿内耳样本，通过单核RNA测序（snRNA-seq）构建了包含42个注释细胞群的图谱，覆盖耳蜗和前庭的感觉上皮、非感觉上皮、神经元及间充质相关群体。通过轨迹推断、调控网络分析和基因集富集分析，研究人员揭示了感觉与分泌谱系的发育程序，发现Hedgehog信号抑制是分泌细胞特化的关键开关，并在人类内耳类器官中通过药物抑制Hedgehog信号成功诱导出前庭暗细胞样群体，验证了图谱的机制预测。该研究将HIEDRA确立为人类内耳发育的参考资源，发表于《Nature Neuroscience》。

**关键技术与方法**
研究主要采用了以下技术：对9例人类胎儿内耳（FW7.1–FW15.1，来自莱顿大学医学中心伦理批准收集的样本）进行单核RNA测序（snRNA-seq），并使用独立的FW12.4耳蜗/前庭分离样本及公开的小鼠数据集进行验证；通过Jaccard相似性分析、典型相关分析（CCA）和LIGER整合进行跨数据集与跨物种比对；利用SCORPIUS进行轨迹推断，GRNBoost2构建基因调控网络，fgsea进行基因集富集分析；使用人类多能干细胞（hPS细胞）来源的内耳类器官（IEO）模型，结合环杷明（cyclopamine）处理、免疫组化和snRNA-seq验证分泌细胞诱导。

**主要结果**

**HIEDRA：构建发育中人类内耳的单核图谱**
研究人员对FW7–15的9例胎儿内耳样本进行snRNA-seq，经质量控制后整合为42个注释细胞群，涵盖耳蜗与前庭上皮（EPCAM）、毛细胞（MYO15A）、间充质（TBX18）、神经元（STMN2）、施万细胞（MBP）、软骨细胞（ACAN）、黑色素细胞（PMEL）、内皮细胞（PECAM1）、免疫细胞（PTPRC）及循环细胞（MKI67）。相关性热图显示相关细胞类型（如耳蜗与前庭毛细胞）具有强转录相关性，而上皮与间充质群体存在明显区分。

**上皮群体反映发育中的空间区域**
耳蜗上皮细胞沿导管底部区分为内侧、前感觉和外侧区域，分别对应未来形成内沟/指间细胞、Corti器和外沟；耳蜗顶部则区分出形成Reissner膜的内侧细胞和形成血管纹边缘细胞的外侧细胞（cLRC）。前庭上皮中，支持细胞分为壶腹相关和耳石相关群体，并鉴定出过渡细胞、暗细胞（vDC）以及内淋巴管/囊细胞等非感觉上皮类型。

**独特信号定义发育中的耳蜗与前庭毛细胞**
耳蜗毛细胞（cHC）在FW10出现，前庭毛细胞（vHC）在最早时间点已被捕获。差异表达分析显示cHC富集UNC5B、ROBO2等基因，vHC富集XIRP2、GALNTL6等基因，但这些差异可能反映毛细胞成熟的时间空间变异而非完全独立的发育程序。

**标记物定义分化的耳蜗与前庭神经元轨迹**
螺旋神经节样神经元（SGN）表达PLXDC2、SEMA3A、NTNG1等标记，前庭神经节样神经元（VGN）富集PCDH9、TAFA2、RGS7，提示两者具有不同的分子身份。

**间充质和共享细胞群体揭示内耳成熟与空间复杂性**
研究鉴定出软骨细胞、两个耳囊样簇（具有成骨细胞样特征）、耳蜗与前庭区域的耳间充质细胞（OMC），以及周细胞、内皮细胞、免疫细胞、黑色素细胞和施万细胞等共享类型。RNA速率分析提示核糖体高表达群体部分向耳囊方向分化，循环群体向OMC方向转变。

**外部数据集和物种比较验证HIEDRA**
利用独立的FW12.4样本和小鼠E16耳蜗/前庭数据，通过Jaccard相似性、CCA和LIGER分析验证了注释的准确性。进一步利用小鼠耳蜗E14/E16/P1参考数据集对HIEDRA耳蜗上皮进行高分辨率注释，识别出更精细的细胞亚型。耳间充质亚型通过免疫组化验证，DACH1标记Corti器下方间充质，OTOR和ATP1A2区分螺旋缘和外螺旋韧带纤维细胞。

**鉴定耳蜗与前庭发育的转录框架**
通过八组成对比较的乘积型元分析，研究人员发现GATA3、THRB、NTF3等为耳蜗富集标记，MEIS2、HMX2/HMX3、IQCJ-SCHIP1等为前庭富集标记，为区分耳蜗与前庭身份提供了候选基因。

**疾病相关基因图谱揭示感觉和分泌谱系的易感性**
将耳聋、梅尼埃病、老年性聋、前庭神经鞘瘤等疾病相关基因映射到HIEDRA细胞类型，发现耳蜗和前庭感觉单位（毛细胞和前感觉导管底）以及分泌单位（cLRC、vDC和黑色素细胞）承载最高的基因负担。RIPOR2突变不仅涉及毛细胞静纤毛，还可能通过OMC功能障碍导致听力损失。

**沿发育轨迹的调控程序建模揭示感觉谱系分化的潜在驱动因子**
轨迹推断将耳蜗感觉分化分为前感觉、感觉和毛细胞三种状态。前感觉状态富集RELN、ITGA8等；感觉状态细胞退出细胞周期，表达GATA3、SOX2、LGR5；毛细胞状态出现内/外毛细胞标记（FGF8、OTOF与INSM1）。基因集富集分析显示PI3K-Akt、Wnt等通路在前感觉/感觉状态活跃，TGF-β和Hippo信号在毛细胞状态受抑制。通过共表达分析，ANKFN1被确定为与静纤毛基因模块在cHC和vHC中均显著正相关的候选基因。前庭毛细胞轨迹也呈现早期支持细胞样、中期毛细胞发育和晚期I/II型毛细胞三种状态。

**沿发育轨迹的调控程序建模揭示Hedgehog信号抑制是分泌细胞命运特化的关键机制**
对cLRC和vDC的轨迹分析揭示了早晚期状态：早期表达GSC、OTX2等侧壁标记，晚期表达DACH1和离子转运基因（ATP1B2、KCNQ1等）。通路富集显示Wnt、TGFβ和Hedgehog信号在早期富集，晚期减弱。Hedgehog通路成分（PTCH1、SMO、GLI2/3）在分泌细胞中表达但缺乏GLI1，提示该通路处于抑制状态。

**靶向Hedgehog抑制在人类内耳类器官中诱导分泌上皮**
在人类内耳类器官中，从D15至D30使用环杷明抑制Hedgehog信号，至D60时处理组出现DACH1阳性、OTX2阴性的暗细胞样上皮，并表达SLC26A4、ATP1B2和BSND，同时黑色素细胞整合并破坏基底膜，重现分泌-黑色素细胞单元。snRNA-seq证实D90类器官中约22%的耳上皮细胞为vDC样群体，而对照组缺乏该群体。

**讨论与结论**
讨论指出，HIEDRA弥补了现有数据集在耳蜗和前庭覆盖度及早期发育窗口方面的不足，并强调了分析内耳作为整合系统的重要性。研究证实Hedgehog信号抑制是耳蜗与前庭分泌细胞共有的分化开关，且这一机制可转化为类器官模型的改进。结论部分认为，HIEDRA不仅是一个参考图谱，更是一个机制框架，通过连接发育轨迹、谱系特异性调控程序和疾病基因表达，支持对人类内耳细胞命运和病理的更精确研究，并为类器官分化方案的优化提供了直接指导。