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CRISPR–Cas系统在很大程度上仅限于RNA引导的核酸酶。本文研究人员展示了与伪DNA（ΨDNA）引导物和RNA靶标结合的Acidaminococcus sp. Cas12a的冷冻电镜结构，揭示了Cas12a如何实现DNA引导的RNA识别。ΨDNA发夹结构
CRISPR–Cas系统在很大程度上仅限于RNA引导的核酸酶。本文研究人员展示了与伪DNA（ΨDNA）引导物和RNA靶标结合的Acidaminococcus sp. Cas12a的冷冻电镜结构，揭示了Cas12a如何实现DNA引导的RNA识别。ΨDNA发夹结构桥接识别叶和核酸酶叶，模拟PAM近端双链体，并定位间隔区以允许沿识别叶形成经典的RNA–DNA异源双链体。这为其活性提供了结构框架，并为未来的工程改造提供了潜在蓝图。
CRISPR–Cas系统是原核生物适应性免疫模块，通过序列引导的核酸靶标识别发挥功能。除天然免疫作用外，这些系统已被重新改造为基因工程的多功能平台，应用于基础研究和治疗领域。经典的CRISPR–Cas系统是RNA引导的酶，其中Cas12a属于class 2 type V家族，通常利用CRISPR RNA（crRNA）引导切割含有前间隔序列邻近基序（PAM）的双链DNA靶标。虽然已有多种CRISPR核酸酶被改造用于RNA靶向，但这些活性通常依赖于RNA引导，并且会对旁观RNA产生非特异性附带切割。近期，研究人员引入了DNA引导的Cas12a，利用工程化的伪DNA（ΨDNA）引导物实现对RNA靶标的高特异性识别，然而Cas12a如何在结构上容纳DNA引导并识别RNA底物仍然未知。这项研究正是针对这一关键问题，通过冷冻电镜技术解析了相关复合物的高分辨率结构。
研究人员通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了Acidaminococcus sp. Cas12a（AsCas12a）与ΨDNA引导物和RNA靶标结合的结构，整体分辨率为3.18 ?（PDB 12YR）。该结构揭示了Cas12a通过结构模拟经典CRISPR组件来实现DNA引导的RNA识别。ΨDNA发夹结构桥接了识别叶和核酸酶叶，模拟了PAM近端双链体的位置和方向，并将间隔区定位为允许沿识别叶形成经典的RNA–DNA异源双链体。这一结构框架不仅解释了Cas12a的RNA靶向活性，也为未来工程改造提供了潜在蓝图。论文发表在《Nature Structural》。
为了开展这项研究，研究人员采用了多种关键技术方法。首先，将密码子优化的AsCas12a基因克隆至pET28载体，在大肠杆菌BL21 DE3中表达，通过镍亲和层析和凝胶过滤纯化获得高纯度蛋白。其次，利用体外反式切割实验，以荧光淬灭DNA探针监测Cas12a的切割活性，评估不同ΨDNA设计和突变体的功能。第三，制备ΨDNA–AsCas12a–RNA三元复合物，在Titan Krios 300 kV透射电镜上收集冷冻电镜数据，利用cryoSPARC进行图像处理和三维重构，最终获得3.18 ?的密度图。第四，使用Coot、ChimeraX、Isolde和PHENIX进行模型构建、精修和验证。这些方法共同支撑了结构解析和功能验证。
**DNA引导的Cas12a的结构（Structure of DNA-guided Cas12a）**
通过冷冻电镜结构分析，研究人员发现ΨDNA引导的AsCas12a采用典型的双叶架构，类似于已有报道的Cas12a与crRNA和dsDNA复合物的结构。ΨDNA发夹桥接两个叶，并以与经典RNA引导系统中PAM近端dsDNA螺旋相同的位置结合PID和WED结构域。ΨDNA设计包含3′端发夹/手柄和5′端间隔区，使AsCas12a以与结合经典dsDNA靶标双链体相同的方向性结合发夹。这种几何排列将ΨDNA间隔区定位在经典R-loop中靶标链（TS）的位置，并保持相同方向性。这解释了5′端手柄活性远低于3′端手柄的观察结果，因为这种核酸几何结构在该结构框架内不相容。同时，结构也支持双手柄ΨDNA（同时具有5′和3′发夹）不会显著影响活性，因为3′端手柄可被正确识别，间隔区穿过酶，而5′端手柄位于核心外的REC2末端。结构还显示，Cas12a的REC叶支撑形成完整的DNA:RNA异源双链体，其轨迹与经典靶标识别期间的R-loop相同，其中靶标RNA位于通常由crRNA占据的位置。40-nt单链RNA靶标的非互补区域从WED和RuvC结构域界面处离开结构，该区域在经典Cas12a结构中预期形成crRNA发夹，但由于该区域被设计为无二级结构，在冷冻电镜重建中未解析。Cas12a中识别crRNA发夹的区域同样未解析，这种灵活性与非经典crRNA可支持Cas12a功能的报道一致。这些观察表明，DNA引导的RNA靶向保留了Cas12a沿间隔区的经典杂合核酸结合特性。
**含经典PAM的ΨDNA增强靶标识别（A canonical PAM-containing ΨDNA enhances target recognition）**
结构分析显示，Cas12a弯曲ΨDNA发夹，以通过先前被表征为识别经典dsDNA靶标中5′ TTTN PAM的氨基酸残基形成PAM类似接触。ΨDNA含有对应于TCTT PAM的残基，位置–2至–4的嘧啶使发夹获得与经典PAM相似的几何形状，从而使AsCas12a通过T38与K603、G23与K548之间的碱基特异性接触稳定发夹。此外，Q784与双链体末端碱基T21形成非经典碱基配对，进一步稳定相互作用。突变实验表明，与磷酸骨架接触的残基N630和K689的替换显著降低Cas12a的反式切割活性，说明骨架接触对结合和稳定DNA发夹至关重要；而参与碱基特异性接触的残基单个丙氨酸替换并不影响活性，表明AsCas12a可以容忍不含经典PAM类似区域的发夹，只要整体双链体几何形状得以保留。研究人员进一步翻转发夹碱基以改变PAM类似区域，得到富含嘌呤的AGAT序列，该序列与TTTN PAM差异显著，但ΨDNA仍表现出显著的反式切割活性，尽管降低约3倍，说明稳定发夹的存在足以让Cas12a容纳非经典PAM。时间过程实验显示，使用TTTA PAM类似发夹时反式切割速率最快，其次为TTTG和TTTC，而无PAM的ΨDNA活性速率显著更慢。这些结果表明Cas12a对ΨDNA的识别是限速步骤，并可通过发夹架构和序列进行调节。此外，由于ΨDNA缺乏完整的非靶标链（NTS），结构解析中RuvC lid和Nuc结构域未解析，表明这些结构域的稳定依赖于与被置换的NTS的相互作用。尽管RuvC lid无序，但AsCas12a仍能稳定结合完全配对的双链体，并具有完全对接的桥式螺旋和REC2结构域，W382封闭了R-loop的PAM远端。
**讨论与结论**
综合来看，这些发现揭示了Cas12a如何通过结构模拟经典CRISPR核酸组件来容纳DNA引导的RNA识别。ΨDNA发夹重建了PAM近端双链体的几何形状，由PAM相互作用结构域稳定，而间隔区在REC叶内形成经典RNA–DNA异源双链体。NTS的缺失改变了与切割激活相关的核酸酶结构域构象，突出了Cas12a在适应替代核酸底物时的结构可塑性。该结构为理解DNA引导RNA靶向的Cas酶提供了框架，并为CRISPR系统的工程化改造提供了指导，以扩展其可编程RNA检测和操作能力，超越Cas12系统。总之，这项研究扩展了CRISPR核酸酶潜在的靶向模式。
