全激动剂与部分激动剂揭示的AMPA受体预激活与门控通路

《Nature Structural & Molecular Biology》：Pre-activation and gating pathway of AMPA receptors revealed by full and partial agonists

　　

AMPA受体（AMPAR）介导快速兴奋性神经传递。AMPAR的门控始于激动剂结合并转入非导电预激活状态，随后转入导电开放状态或非导电脱敏状态。虽然终末apo、开放和脱敏状态已有结构表征，中间预激活状态仍是谜。与全激动剂谷氨酸（Glu）相比，部分激动剂降低开放状态最大占有率，并增加预激活状态出现概率。研究人员利用不同部分激动剂和时程冷冻电子显微镜（cryo-EM）捕获GluA2–γ2 AMPAR复合物在关闭apo、预激活、开放和脱敏状态的结构集合。部分激动剂结合配体结合结构域（LBD）导致不同程度上蛤壳闭合，闭合超过约17°阈值进入开放和脱敏状态，较小闭合稳定预激活状态。预激活状态具有区别于完全开放与关闭两种离散状态的门构象。结合单通道电流记录与分子动力学（MD）模拟，结构结果揭示AMPAR完整门控通路，并阐明部分激动作用与预激活的分子机制。

研究背景方面，AMPA受体（AMPAR，一种离子型谷氨酸受体iGluR）负责哺乳动物中枢系统快速兴奋性传递，其门控由激动剂结合从非导电apo关闭状态起始，经瞬态预激活状态P_A，再走向导电开放状态O_A*或非金属导电脱敏状态D_A。已有研究解析了关闭、开放、脱敏三类终末状态，但预激活这一必需中间态长期缺乏高分辨率全长为通道结构，限制了对其完整门控通路与部分激动机制的认知。之所以开展本研究，是因为部分激动剂如海人酸（KA）与willardiine衍生物可使受体亚最大化激活、提高P_A占用，却因早年晶体结构跨膜域（TMD）解析差，门区无法与关闭态区分，因此研究人员以部分激动剂配合时间分辨cryo-EM在室温无正变构调节剂（PAM）条件下补全流程。

研究人员以大鼠GluA2融合小鼠TARP γ2（stargazin）为模型，用全激动剂Glu与部分激动剂KA、硝基-willardiine（NOW）、氟-willardiine（FW）、碘-willardiine（IW）短时加药后 plunge-freeze，获得apo及多态集合，并结合膜片钳、平面脂双层单通道记录与平衡分子动力学模拟，得出预激活态结构可被捕获、LBD蛤壳闭合约15°–16°、超过约17°才驱动开放/脱敏、门区M3在A/C亚基解旋一螺旋圈且在B/D亚基倾斜但孔道仍封口等结论。该工作发表于《Nature Structural & Molecular Biology》，意义在于把iGluR门控从“关闭—开放—脱敏”补全为含P_A的四态通路，并解释部分激动剂为何只给亚最大电流。

关键技术方法上，研究人员采用时间分辨单颗粒cryo-EM，在加药后短于2.5 s plunge-freeze以捕获瞬态；样本为HEK 293细胞表达的GluA2–γ2纯化复合物。功能端用全细胞贴壁膜片钳评估峰/稳态电流，用平面脂双层单通道记录观察O1–O4亚电导；计算端做嵌入脂双层的平衡MD模拟，以水分子渗透速率和T617的χ₁二面角判别关闭与开放。

研究结果部分，功能表征显示部分激动剂峰电流小于Glu、稳态电流大于Glu，提示状态占用不同。构象集合显示IW偏开放、KA只给预激活、NOW三者皆有、FW与Glu偏开放/脱敏。结构上海人酸结合预激活态具Y形三层架构，ATD形成A/B、C/D二聚，LBD为A/D、B/C反向二聚，TMD由M1、M2重入环、M3、M4构成假四重对称孔道，γ2以TM3/TM4贴M1/M4、β环碰D2。

LBD构象集合中，apo蛤壳全开，KA预激活闭合约15°–16°，开放18°–27°、脱敏24°–27°，约17°是阈值；二聚层面P_A保D1–D1界面、D2–D2拉开到24 ?，开放拉到28 ?，脱敏则破D1–D1、D1–D1距变大；四聚扩展以B/D对角S635距离衡量，预激活居中、开放最强、脱敏同apo。

门控分子转变中，apo门由M3胞外段SYTANLAAF形成，A/C亚基M3多一圈；预激活时B/D的M3轻度倾斜、A/C从T625解旋一圈，但T617/A621仍封口；开放时B/D在A618铰链弯折、A/C再倾斜，孔扩开；脱敏时LBD扩展消失，门回apo样。

孔几何中，M2选择滤器各态几乎不变；胞外门区apo/脱敏最窄、预激活上次宽但仍不能在T617/A621通水、开放宽到可渗；孔半径曲线聚成关闭/脱敏、预激活、开放三类。单通道电流显示各激动剂都有O1–O4，Glu的O1/O2相近、KA无O3/O4，电导值跨激动剂相似而概率不同。MD中KA/NOW预激活水平水渗透0.65/0.84 ns^-1、孔脱水；开放态NOW 6.6、IW 9.3、FW 5.7、Glu 10.4 ns^-1，T617阻孔构象全激动剂把B/D推向非阻孔，对应O1/O2边界。

讨论部分总结，早期分离LBD研究认为效力正比于闭合度，后来晶体与NMR、FRET、MD表明部分激动剂也可全闭，效力取决于全闭构象稳定性；无辅助亚基结晶损伤TMD，使门像关闭态，NOW晶体12.3°与cryo-EM 15.4°差异也来自此。本研究cryo-EM无这些畸变，更近生理。

结论翻译：激动剂结合后iGluR门控需要一个激动剂结合预激活中间态，作为通向开放或脱敏的临时检查点。研究人员用时间分辨cryo-EM配合全/部分激动剂解出GluA2–γ2完整门控路径含神秘P_A。起始LBD中等闭合且D1–D1二聚界面完好，经M3–S2连接子传中等拉力，使A/C的M3解旋一圈、B/D微倾，但孔仍不通水离子；要导电必须B/D的M3剧烈弯折，关闭、预激活、开放间孔作三离散切换。