基于安全水疱性口炎病毒（VSV）载体的高效鼻内H5N1疫苗

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Highly efficient intranasal H5N1 vaccine based on a safe vesicular stomatitis virus (VSV) vector

　　

重组水疱性口炎病毒（rVSV）正成为一种日益流行的疫苗载体，但仍面临构建困难、体外扩增滴度低、安全性隐患以及黏膜免疫效果不确定等挑战。因此，迫切需要构建具有高免疫原性和优异安全性的新型VSV载体，用于下一代疫苗研发。本研究独立构建了一个高表达的6-9G重组具有复制能力的VSV载体。在此基础上，研究人员在M基因中引入定点突变，包括第51位氨基酸缺失（Δ51）、Δ51+V221F和Δ51+S226R，分别获得命名为6-9G-Δ51、6-9G-Δ51+V221F和6-9G-Δ51+S226R的载体。通过体外复制动力学和体内免疫原性研究，研究人员筛选出具有良好安全性和强免疫原性的6-9G-Δ51+S226R载体。高致病性禽流感病毒H5亚型2.3.4.4b分支对全球大流行构成威胁，亟需新的防控策略。基于6-9G-Δ51+S226R载体，研究人员通过以血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）基因替换VSV-G基因，构建了6-9ΔGΔ51+S226R-H5N1流感病毒载体疫苗。该候选疫苗在安全性进一步改善的同时，两剂免疫后可诱导强烈且持久的体液免疫应答和黏膜免疫应答，并在致死性病毒攻击中为小鼠提供100%保护。成功开发的新型6-9ΔGΔ51+S226R-H5N1疫苗候选株不仅具有优异的安全性和免疫原性，而且是有效防控高致病性禽流感的强大潜在工具。

**论文解读：基于安全VSV载体的高效鼻内H5N1疫苗研究**

高致病性禽流感H5N1病毒因具有跨种传播能力和高致死率，持续威胁全球公共卫生安全。传统灭活疫苗和减毒活疫苗虽然发挥重要作用，但面对H5N1这类易变异且大流行潜力高的病原体，仍存在研发周期慢、规模化困难、难以有效诱导细胞免疫等局限。水疱性口炎病毒（VSV）载体因在人体中无预存免疫、可诱导强免疫反应，且基于VSV的埃博拉疫苗已成功上市，展现出独特优势。然而，现有VSV载体仍面临构建困难、体外扩增滴度低、M和G基因相关神经毒性，以及黏膜免疫效果不确定等问题。因此，亟需开发一种既高效表达、免疫原性高，又低毒或无毒的改良重组VSV载体。该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。

研究人员独立构建了高表达的6-9G重组复制型VSV载体，并在M基因中引入Δ51、Δ51+V221F和Δ51+S226R系列突变，通过体外复制动力学和体内免疫原性筛选，获得安全性显著改善且免疫原性强的6-9G-Δ51+S226R载体。在此基础上，利用H5N1 F3SM281株（clade 2.3.4.4b）的HA和NA基因替换VSV-G基因，构建了6-9ΔGΔ51+S226R-H5N1疫苗。两剂鼻内免疫可诱导强烈、持久的体液和黏膜免疫应答，并在致死性病毒攻击中为小鼠提供100%保护。

研究人员主要采用以下关键技术方法：反向遗传学病毒拯救系统构建重组VSV载体；M基因定点突变；在PC3和Vero细胞中评估复制动力学，结合荧光斑点计数进行病毒滴定；通过脑内和鼻内接种BALB/c小鼠测定半数致死量（LD₅₀）评价体内安全性；采用数据非依赖采集质谱（DIA-MS）蛋白质组学结合KEGG和基因集富集分析（GSEA）解析减毒机制；利用小鼠免疫攻毒模型评价疫苗保护效果，并通过ELISA、微量中和试验、实时荧光定量PCR和组织病理学检测免疫应答与病毒载量。其中，H5N1 F3SM281毒株和BALB/c小鼠均来自中国医学科学院医学生物学研究所。

研究结果分述如下：

**重组VSV载体构建及体外复制能力评价**：研究人员构建了6-9G及三种M基因突变载体，以商品化pr-VSV-G-GFP为阳性对照。在Vero细胞中，6-9G-Δ51、6-9G-Δ51+V221F和6-9G-Δ51+S226R的病毒滴度分别较对照提高47.3倍、47.6倍和44.9倍，表明这些载体可在Vero细胞中高效生产。

**系列重组VSV载体的体内安全性评价**：通过脑内和鼻内感染BALB/c小鼠，未修饰的6-9G和pr-VSV-G-GFP组小鼠全部死亡，而M基因修饰组体重逐步恢复。脑内注射后，6-9G-Δ51+S226R组脑组织病毒载量较对照降低17.2倍，LD₅₀较6-9G组提高19714倍，证实M蛋白第51和226位氨基酸是VSV毒力的关键决定因素。

**免疫途径与免疫原性评价**：比较6种免疫途径发现，鼻内（IN）途径最早在免疫后第7天即可诱导血清中和抗体，是快速激发体液免疫的理想途径。6-9G-Δ51+S226R载体在保持低毒性的同时，可诱导高滴度且可持续至第49天的中和抗体。

**蛋白质组学和基因组学阐明减毒机制**：对小鼠脑组织进行蛋白质组学分析，发现6-9G-Δ51+S226R组中NF-κB通路相关免疫受体和信号复合物上调，而NF-κB抑制因子下调；ISG通路亦呈显著差异表达；钙信号通路和神经受体-配体相互作用等神经损伤相关通路在未减毒6-9G组中显著上调。这表明减毒机制不仅源于复制受限，还与增强天然免疫识别和快速抗病毒遏制有关。

**重组6-9ΔGΔ51+S226R-H5N1的表征与安全性评价**：Western blot证实病毒粒子成功表达M蛋白和HA蛋白。该重组病毒在Vero细胞中复制动力学较亲本病毒更慢，但后期滴度平台更高；脑内接种小鼠的LD₅₀超过5×10⁶ FFU，较亲本载体6-9G-Δ51+S226R提高10倍以上，安全性进一步改善。

**两剂免疫6-9ΔGΔ51+S226R-H5N1对致死性攻击的保护**：两剂鼻内免疫（10⁵ FFU）后，疫苗组诱导了10³～10⁴的血清中和抗体，支气管肺泡灌洗液（BALF）中检出IgA，血清IgG滴度达10⁴～10⁵。致死性攻毒后，疫苗组小鼠仅出现短暂轻微体重下降并全部存活，肺、鼻甲和气管组织病毒载量较PBS组显著降低，肺部病理损伤明显轻于蛋白对照组。

**两剂免疫6-9ΔGΔ51+S226R-H5N1提供持久免疫保护**：长期观察至第250天，10⁶ FFU和10⁵ FFU剂量组均维持可检测的中和抗体。第250天致死性攻毒后，两个疫苗剂量组和蛋白组均保持100%存活，鼻甲和气管组织病毒载量较PBS组降低约5个对数数量级，肺组织病理改变轻微。

讨论部分指出，M基因Δ51+S226R突变可解除M蛋白对干扰素表达的抑制，激活NF-κB和ISG通路，增强先天免疫识别并限制病毒复制，同时避免过度的钙信号相关神经损伤。6-9G-Δ51+S226R载体在Vero细胞中可实现高滴度生产，适合规模化制造。鼻内免疫模拟自然感染途径，可诱导黏膜IgA，较肌注重组蛋白疫苗更具优势。研究也存在一定局限，如未在VSV-H5N1免疫原性评价中设置空载体对照，但储存的空载体免疫血清对F3SM281病毒中和活性均为阴性；另外，动物模型结果可能不能完全反映人体生理特性，后续需利用人源类器官进一步评估载体安全性。

研究结论可概括为：成功开发的新型6-9ΔGΔ51+S226R-H5N1疫苗候选株不仅具有优异的安全性和免疫原性，而且代表了有效防控高致病性禽流感的强大潜在工具。