《Nature Communications》：Recurrent mechanisms of biallelic epigenetic inactivation reveal new putative tumour suppressor genes in prostate cancer
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摘要翻译：肿瘤抑制基因的失活是癌症发生发展中的关键步骤，通常通过纯合性缺失实现。然而，在前列腺癌中，大片段基因组区域常发生半合子缺失，这使得在该区域中鉴定推定肿瘤抑制基因变得复杂。在本研究中，研究人员开发了Epi2Hit，这是一种整合全基因组测序、表观基因组分
摘要翻译：肿瘤抑制基因的失活是癌症发生发展中的关键步骤，通常通过纯合性缺失实现。然而，在前列腺癌中，大片段基因组区域常发生半合子缺失，这使得在该区域中鉴定推定肿瘤抑制基因变得复杂。在本研究中，研究人员开发了Epi2Hit，这是一种整合全基因组测序、表观基因组分析和基因表达的综合计算方法，用于识别涉及一个等位基因的启动子及增强子区域DNA甲基化和另一个等位基因基因组缺失的肿瘤抑制基因双等位基因失活。研究人员将Epi2Hit应用于一个包含2,021例前列腺癌的队列以发现肿瘤抑制基因。特别地，研究人员识别出ZFHX3的表观遗传双等位基因失活，其复发水平与TP53相似。ZFHX3是一种转录抑制因子，其双等位基因失活导致包括MYC在内的癌基因上调，并缩短转移发生时间。最后，研究人员提供了证据表明，作为第二次打击的表观遗传沉默在邻近必需基因的区域特别富集，从而排除了纯合性缺失的可能性。
论文解读：Epi2Hit方法揭示前列腺癌中双等位基因表观遗传失活的新型肿瘤抑制基因
**研究背景与问题**
前列腺癌是男性中第二大常见恶性肿瘤，其分子水平高度异质性，体细胞单核苷酸变异驱动因子较少，但结构变异频繁，常导致拷贝数缺失。约10%的前列腺癌基因组在超过20%的肿瘤中发生复发性缺失，但这些区域中仅有一小部分含有已知的前列腺癌驱动基因。肿瘤抑制基因通常经历双等位基因失活，Knudson提出的“二次打击”假说是理解肿瘤抑制基因的基石。在前列腺癌中，PTEN、TP53、CHD1和BRCA1/2等肿瘤抑制基因常通过拷贝数缺失和单核苷酸变异组合的方式发生双等位基因失活。
然而，通过启动子和增强子区域高甲基化实现表观遗传沉默是另一种失活机制，通常与另一等位基因的基因组失活同时发生。涉及一个等位基因拷贝数缺失和另一个等位基因表观遗传沉默的双等位基因失活，除少数显著例子如MLH1、BRCA1、MGMT和APC外，仍鲜有系统探索。尽管这一机制具有公认的重要性，但以往研究受限于较小的基因面板、低分辨率方法或缺乏对基因组改变、DNA甲基化和表达的系统整合，因此一种全面的方法来阐明双等位基因失活的多面性仍然缺失，限制了研究人员对疾病进展和相关基因的理解。
**研究内容与意义**
针对上述问题，研究人员开发并应用了一种整合计算方法Epi2Hit，该方法整合半合子基因组破坏与调控性CpG位点高甲基化，以前列腺癌中双等位基因失活的肿瘤抑制基因。通过利用体细胞改变信息与HM450甲基化阵列、ATAC测序、Hi-C和RNA测序数据，该方法为发现通过基因组和表观遗传双等位基因失活的肿瘤抑制基因提供了互补支持。研究人员将Epi2Hit应用于泛前列腺癌组队列，发现ZFHX3的表观遗传双等位基因失活频率与TP53相当，且ZFHX3失活导致MYC等癌基因上调并缩短转移时间。此外，研究还揭示了邻近必需基因对肿瘤抑制基因失活机制的影响。该研究发表于《Nature Communications》，为理解前列腺癌中表观遗传失活机制和发现新型肿瘤抑制基因提供了重要见解。
**关键技术方法**
研究人员利用了泛前列腺癌组队列中991例原发性前列腺癌的全基因组测序数据、1268例样本的450K甲基化阵列数据以及1292例样本的RNA-seq数据，并整合了外部独立队列的ATAC-seq数据（GSE188797）和Hi-C染色质环数据（GSE164347）。主要技术方法包括：基于Battenberg算法的等位基因特异性拷贝数分析；基于KDE优化的多峰分布检测方法鉴定差异甲基化CpG位点；将调控性CpG位点与基因表达进行线性回归以鉴定表达相关CpG位点（eCpGs）；整合拷贝数缺失与eCpG甲基化状态鉴定Epi2Hit候选基因；并使用Oxford Nanopore长读长测序进行等位基因特异性甲基化和拷贝数验证。
**研究结果**
*Epi2Hit方法在前列腺癌中的建立*
研究人员首先分析了991例前列腺癌的拷贝数缺失模式，发现8%的基因组区域发生复发性且几乎 exclusively 半合子缺失，主要位于2、3、5、8和16号染色体。在5492个经历复发性半合子缺失的基因中，22%（n=1187）同时显示差异甲基化，代表通过遗传和表观遗传机制组合实现双等位基因失活的候选基因。研究人员确认了开放染色质区域中CpG对转录的调控作用更强，并使用线性回归验证了关键肿瘤抑制基因如APC、PTEN和NOTCH1中CpG高甲基化的转录抑制效应。基于此，研究人员开发了Epi2Hit计算流程，整合基因组、转录组和表观基因组数据及临床注释，最终鉴定出155个Epi2Hit候选基因。
*基于Epi2Hit发现具有表观遗传失活机制的肿瘤抑制基因*
研究人员系统鉴定了发生基于基因组的双等位基因失活事件，并在PPCG队列中失活频率超过2%的肿瘤抑制基因中，发现多个已知和既往发表的具有肿瘤抑制功能的Epi2Hit候选基因，包括PSD3（5%）、ZFHX3（5%）、RBPMS（4%）、APC（3%）、PDE4D（2%）和KLF5（2%）。DepMap CRISPR依赖性数据支持这些基因在癌细胞系中通常为非必需基因。Epi2Hit样本中基因表达显著降低。在8p臂上，尽管纯合性缺失罕见，研究人员观察到包括NKX3-1在内的多个基因的复发性表观遗传失活。以APC为例，研究人员验证了Epi2Hit方法识别的eCpG位点位于启动子1A区域，其甲基化水平与APC基因表达强反相关，而启动子1B不受影响。通过TCGA-PRAD外部验证队列，研究人员确认了PPCG队列中的主要发现，6/7的顶级Epi2Hit肿瘤抑制基因在TCGA-PRAD队列中也是高频改变基因。
*ZFHX3双等位基因失活驱动MYC表达并与更具侵袭性的前列腺癌相关*
研究人员鉴定出ZFHX3是频繁发生Epi2Hit的基因之一。ZFHX3是锌指同源盒转录抑制因子，已知结合并抑制多个基因的转录。通过Oxford Nanopore长读长测序，研究人员在Epi2Hit前列腺癌样本中证实了等位基因1缺失和等位基因2在eCpG（cg16563255）处发生等位基因特异性高甲基化，β值范围为0.82-0.9。Hi-C数据显示该eCpG区域与ZFHX3启动子区域形成长距离染色质环，提示其为调控ZFHX3转录的关键增强子元件。ZFHX3失活与PTEN缺失（q=0.007）或TP53缺失（q<0.0001）共发生，且与MYC拷贝数增加显著互作（比值比=6，q<0.0001）。ZFHX3 Epi2Hit样本中MYC表达显著上调（p=0.03）。利用染色质数据，研究人员证实ZFHX3结合MYC基因座内前列腺特异性启动子区域的特定结合位点，该区域具有活性染色质标记H3K4me3，支持ZFHX3通过结合MYC调控元件作为转录抑制因子的作用。此外，研究人员还鉴定出11个ZFHX3结合位点邻近启动子的前列腺癌相关基因，其中肿瘤抑制功能相关基因如CDH1和MUTYH在ZFHX3 Epi2Hit肿瘤中下调，驱动致癌过程的基因如SF3B1和PLEC则显示更高表达水平。临床相关性分析显示，ZFHX3失活在高级别Gleason分级组（GG3-5）中显著富集（卡方检验：P=0.0004），且ZFHX3失活患者转移时间更短（log-rank检验P=0.0007）。然而，在同伴研究中，ZFHX3失活并非多变量Cox模型中的独立预后因素，提示其与其他侵袭性疾病标志物相关。
*邻近必需基因影响肿瘤抑制基因失活机制*
研究人员探究了PTEN等经常发生双等位基因缺失的肿瘤抑制基因与KLF5和ZFHX3等表现为一个等位基因缺失和另一个等位基因表观遗传沉默的Epi2Hit基因之间失活机制差异的原因。研究发现，与纯合性缺失基因相比，Epi2Hit肿瘤抑制基因如KLF5和ZFHX3确实位于常见必需基因附近。这种邻近性可能阻止了通过双等位基因缺失实现的完全失活，从而倾向于半合子缺失和高甲基化作为替代失活机制。扩展分析显示，必需基因在经历Epi2Hit的肿瘤抑制基因附近显著富集（卡方检验，P=0.006）。定量评估显示，Epi2Hit基因与最近必需基因的距离显著近于纯合性缺失的肿瘤抑制基因，该关联在调整基因长度和局部基因密度后仍显著。必需基因的表达水平显著高于肿瘤抑制基因，支持保留其表达可能阻止邻近纯合性缺失的模型。这些发现强调了在肿瘤抑制基因失活中考虑甲基化作为第二次打击的重要性，特别是对于位于必需基因附近的肿瘤抑制基因。
**讨论与结论**
研究人员开发了一种整合遗传和表观遗传机制的系统性鉴定肿瘤中肿瘤抑制基因双等位基因失活的整合计算方法。该方法通过利用与基因表达变化直接关联的CpG位点来识别推定Epi2Hit肿瘤抑制基因，将其与非功能性CpG区分开来。对APC的分析验证了启动子特异性调控在肿瘤抑制基因沉默中的重要性。研究鉴定了包括PSD3、PDE4D、RBPMS、APC和ZFHX3在内的已知和未知的肿瘤抑制基因经历Epi2Hit，其中ZFHX3 Epi2Hit的复发频率使之成为分析中第五个最频繁的双等位基因失活肿瘤抑制基因，超过了BRCA2和APC等已确立的肿瘤抑制基因。
研究人员指出，Epi2Hit的应用不限于前列腺癌，可扩展到其他肿瘤类型，且与大规模多组学数据集兼容。表观遗传沉默基因的鉴定也为靶向治疗开辟了途径，DNA去甲基化剂如地西他滨和阿扎胞苷已在临床前和临床研究中显示出抗肿瘤效果。去甲基化策略的转化潜力值得进一步探索。方法学上，450K阵列的探针设计偏向CpG岛和启动子区域，可能遗漏增强子等关键调控元件，而全基因组亚硫酸盐测序或纳米孔测序等无偏方法可检测预设区域之外的所有eCpG。长读长测序技术还能捕获短读长技术遗漏的等位基因特异性表观遗传景观与基因组改变的复杂互作。
总之，Epi2Hit工作流程使研究人员能够发现包括ZFHX3（MYC的关键调控因子）在内的肿瘤抑制基因失活机制，并能够更系统地研究表观遗传学作为癌症中肿瘤促进机制的作用。前列腺癌中纯合性缺失在必需基因附近被耗尽，而Epi2Hit事件则不然，表明这些缺失受到必需基因邻近性的限制，此时倾向于Epi2Hit机制。该模型进一步暗示，额外的Epi2Hit失活肿瘤抑制基因可能位于必需基因附近。Epi2Hit在其他癌症类型中的应用、潜在治疗意义及与长读长测序的未来整合，凸显了其作为癌症基因组学中通用且强大方法的价值。
