壳聚糖包被脂质纳米载体共递送姜黄素与α-萜品烯通过氧化应激增强对致倦库蚊（Cx. pipiens）的杀幼虫活性

《Scientific Reports》：Chitosan-coated lipid nanocarriers co-delivering curcumin and α-terpinene with enhanced larvicidal activity against Cx. pipiens via oxidative stress

　　

全球蚊媒疾病的负担日益加重，这些疾病主要由致倦库蚊（Cx. pipiens）等媒介传播，凸显了对创新且生态可持续控制剂的迫切需求。为应对这一挑战，本研究聚焦于合成和表征负载姜黄素与α-萜品烯两种天然化合物的脂质基质双药纳米结构脂质载体（NLC-CA）及其壳聚糖包被纳米制剂（NLC-CA@CS），评估其作为生态友好型致倦库蚊控制剂的效果。所合成的壳聚糖包被纳米系统呈核-壳结构，粒径为91.28 nm，正ζ电位（+22.9 mV），对两种活性成分的包封率均高于72%，且与游离化合物相比，对正常WI-38细胞的细胞毒性显著降低。对致倦库蚊幼虫（24 h）的杀幼虫试验显示，半数致死浓度（LC₅₀）分别为789.46 μg/mL（NLC-CA）、705.3 μg/mL（NLC-CA@CS）、821.08 μg/mL（α-萜品烯）和6967 μg/mL（姜黄素）。在机制上，该活性归因于诱导显著的氧化应激，抗氧化和脂质过氧化生物标志物出现明显的时间和浓度依赖性扰动即为证据。暴露于NLC-CA@CS触发了超氧阴离子自由基和脂质过氧化的显著增加，同时伴随抗氧化防御系统的复杂调节，包括超氧化物歧化酶（SOD）活性和总抗氧化能力（TAC）。这些生化紊乱最终在24 h后于1000 μg/mL浓度下导致显著的幼虫死亡率。研究结果共同表明，由天然化合物合成的NLC-CA@CS是一种良好、靶标选择性且具有生化活性的纳米杀幼虫剂，有望成为可持续媒介管理策略的候选制剂。

【研究背景】蚊媒疾病在全球范围内持续构成严重公共卫生威胁，致倦库蚊（Cx. pipiens）作为西尼罗病毒等多种病原体的重要传播媒介，其防控形势严峻。传统化学杀虫剂普遍存在靶标选择性差、有效利用率不足0.1%、环境残留及媒介抗药性等问题。天然活性化合物姜黄素与α-萜品烯虽各自具有杀幼虫活性，但均存在稳定性差、水溶性低等缺陷；此前尚无研究将二者共载于同一壳聚糖包被脂质纳米载体中，其联合杀虫功效与协同潜力尚属空白。该论文发表于《Scientific Reports》，研究人员据此开展本研究，旨在开发一种基于天然化合物的生态友好型纳米杀幼虫平台。

【研究概况】研究人员采用热均质-超声法合成共载姜黄素与α-萜品烯的纳米结构脂质载体（NLC-CA），并通过离子凝胶法以壳聚糖和三聚磷酸钠（STPP）进行表面包被，获得壳聚糖包被制剂（NLC-CA@CS）。研究证实，NLC-CA@CS对致倦库蚊幼虫具有增强的杀幼虫活性、良好的体外安全性，并通过诱导持续性氧化应激发挥杀虫作用，为可持续媒介综合管理提供了新策略。

【关键技术方法】主要方法包括：热均质-超声法制备NLC-CA；离子凝胶法制备NLC-CA@CS；动态光散射（DLS）与透射电子显微镜（TEM）表征理化性质；超滤离心结合紫外-可见分光光度法测定包封率（EE%）与载药量（LC%）；MTT法评估WI-38正常肺成纤维细胞毒性；针对四龄早期致倦库蚊幼虫开展杀幼虫生物测定并计算半数致死浓度（LC₅₀）；分光光度法检测超氧阴离子自由基、脂质过氧化物、超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（TAC）及酚类水平。供试致倦库蚊幼虫来自埃及吉萨Dokki医学研究所，于开罗大学昆虫学系实验室传代饲养。

【研究结果】（合成与纳米递送）NLC-CA粒径为37.84±4.9 nm，ζ电位为-19.3±1.7 mV；壳聚糖包被后粒径增至91.28±7.5 nm，ζ电位转为+22.9±2.4 mV，证实壳聚糖层成功包被。（透射电子显微镜）TEM显示NLC-CA呈球形或类球形，粒径80～200 nm；包被后部分颗粒达170～290 nm，与DLS水合粒径的差异源于干燥态与溶液态测量原理不同。（包封率与载药量）姜黄素EE%为83.56±3.22%，α-萜品烯EE%为72.45±1.98%；LC%分别为19.98±0.67%和11.37±0.69%，表明脂质基质对疏水性活性成分具有良好负载能力。（细胞毒性评价）游离姜黄素IC₅₀为50.81 μg/mL，α-萜品烯为179.05 μg/mL；NLC-CA为250.11 μg/mL，NLC-CA@CS达339.40 μg/mL，为最低细胞毒性组，表明壳聚糖包被可屏蔽药物对正常细胞的不良作用。（杀虫活性）24 h杀幼虫试验显示NLC-CA@CS的LC₅₀最低（705.31 μg/mL），优于NLC-CA（789.46 μg/mL）和α-萜品烯（821.08 μg/mL），姜黄素活性最弱（6967.39 μg/mL），证明纳米包封显著增强杀幼虫效果。（酚类浓度影响）各制剂均呈时间和浓度依赖性改变酚类水平，NLC-CA@CS处理后酚类浓度随浓度升高逐渐增加，在1000 ppm达峰值，但随时间延长较1 h时显著降低。（超氧阴离子自由基）NLC-CA@CS在250 ppm时超氧阴离子水平升至峰值，之后随浓度增加（500、1000 ppm）逐渐下降；游离姜黄素在高浓度（500、1000 ppm）时24 h超氧水平显著低于1 h。（SOD活性）NLC-CA@CS在1 h时SOD活性显著高于其他时间点，250和500 ppm活性最高；6、12、24 h后SOD活性随浓度逐渐升高，在1000 ppm达最大。（总抗氧化能力）NLC-CA@CS在125和250 ppm浓度下处理24 h后TAC水平显著升至最高；500和1000 ppm时24 h TAC较1 h显著降低。（脂质过氧化物）NLC-CA@CS在125 ppm时脂质过氧化物水平较对照组显著升高，并持续至1000 ppm；各浓度在24 h时较1 h均显著升高，提示脂质过氧化损伤累积。（死亡率）NLC-CA@CS在12 h和24 h时死亡率受浓度显著影响，最高死亡率出现在24 h、1000 ppm处理组。

【讨论总结】研究证实壳聚糖正电荷表面可通过静电作用增强对幼虫体表负电荷几丁质层的黏附，提高靶向递送效率；DLS与TEM粒径差异源于测量原理不同。纳米包封显著降低游离药物对哺乳动物细胞的毒性，提高制剂安全性。氧化应激生物标志物（超氧阴离子、脂质过氧化物、SOD、TAC及酚类）的协同变化表明，NLC-CA@CS通过诱导持续性氧化应激扰乱幼虫抗氧化防御系统，最终导致幼虫死亡。

【研究结论】研究人员成功开发了共包封姜黄素与α-萜品烯的壳聚糖包被纳米结构脂质载体（NLC-CA@CS）。该制剂对致倦库蚊展现出增强的杀幼虫功效和良好的体外安全性，诱导与单一组分不同的持续性氧化应激反应，并与延迟性死亡率相关。该工程化纳米载体在致倦库蚊防治中表现出良好活性。未来研究应阐明毒性的分子机制、评估对非靶标物种的环境安全性，并在田间条件下验证有效性；同时需优化活性成分比例并扩大生产规模，开展遵循世界卫生组织（WHO）指南的半田间和小规模田间试验，评估紫外线稳定性、水体基质效应及非靶标生物安全性，并针对不同暴露途径（角质形成细胞、肝细胞、肠上皮细胞）开展细胞毒性研究。