《Virulence》：EspF acts as a molecular scaffold to facilitate TRIM25-mediated NLRP3 inflammasome activation during mycobacterial infection
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分枝杆菌 ESX-1（Type VII）分泌系统对毒力至关重要，并可诱导 NLRP3 炎症小体激活。然而，除已充分研究的 EsxA（ESAT-6）外，参与该过程的具体细菌效应蛋白仍大多未被鉴定。研究人员通过对 ESX-1 效应蛋白进行系统筛选，鉴定出 EspF
分枝杆菌 ESX-1（Type VII）分泌系统对毒力至关重要，并可诱导 NLRP3 炎症小体激活。然而，除已充分研究的 EsxA（ESAT-6）外，参与该过程的具体细菌效应蛋白仍大多未被鉴定。研究人员通过对 ESX-1 效应蛋白进行系统筛选，鉴定出 EspF 是结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）和海分枝杆菌（M. marinum）等致病分枝杆菌中一种强效且进化保守的 NLRP3 炎症小体激活因子。研究结果表明，EspF 可显著增强 THP-1 细胞中成熟 IL-1β 和 IL-18 释放、ASC 斑点形成、caspase-1 激活以及 gasdermin D（GSDMD）介导的细胞焦亡（pyroptosis）。值得注意的是，感染过表达 EspF 的耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）或牛分枝杆菌卡介苗（BCG）菌株可显著增强 NLRP3 炎症小体激活和细胞焦亡，而在 NLRP3 缺陷细胞中这些效应被完全消除。机制上，EspF 直接与 NLRP3 的 NACHT 和 LRR 结构域相互作用；无偏蛋白质组学筛选进一步鉴定宿主 E3 泛素连接酶 TRIM25 为关键结合伙伴。研究人员在 THP-1 细胞中证实了 EspF–TRIM25–NLRP3 复合物的内源性相互作用和共定位，证明 EspF 作为分子支架将 TRIM25 桥接到 NLRP3。该邻近互作在分枝杆菌感染期间经原位验证，可促进 TRIM25 介导的 NLRP3 K63 连接泛素化。体内实验中，过表达 EspF 的 BCG 感染小鼠出现肺病变加重、炎症细胞浸润增加和菌载升高。综上，EspF-TRIM25-NLRP3 轴是分枝杆菌致病的新机制，可驱动过度炎症以促进细菌存活和播散。
研究背景方面，结核病（tuberculosis, TB）由结核分枝杆菌（M. tuberculosis, Mtb）引起，仍是全球单一传染因子导致死亡的首要原因。尽管卡介苗（Bacille Calmette-Guérin, BCG）和多药治疗已使用数十年，耐多药和广泛耐药菌株仍威胁公共卫生。Mtb 作为高度适应的胞内病原体，主要靶向肺泡巨噬细胞并操纵宿主免疫。NLRP3 炎症小体可成熟 IL-1β 与 IL-18 并通过 GSDMD 介导细胞焦亡，炎症反应具“双刃剑”效应：既参与早期抑菌，也可致过度炎症和组织损伤。ESX-1（Type VII）分泌系统对吞噬体膜破坏及效应蛋白转位至胞质必不可少，且为 NLRP3 激活所需；但除 EsxA（ESAT-6）外，其他 ESX-1 效应蛋白如何调控 NLRP3 仍不清楚。因此，鉴定未知细菌调节因子对理解分枝杆菌致病机制、开发宿主导向治疗（host-directed therapies, HDTs）具有重要意义。研究人员开展系统筛选，发现保守 ESX-1 效应蛋白 EspF 可作为分子支架招募 TRIM25 至 NLRP3，促进 K63 连接泛素化、炎症小体激活与焦亡，并在体内加剧肺病损和菌载。该论文发表于《Virulence》。
主要关键技术方法方面，研究人员使用 HEK293T 与 THP-1 细胞模型、慢病毒诱导表达系统、siRNA 敲低与 CRISPR/Cas9 敲除细胞系；通过免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, Co-IP）、体外 pull-down、激光共聚焦显微镜、无偏液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）蛋白质组学筛选、邻近连接原位 assay（proximity ligation assay, PLA）分析蛋白邻近；感染模型包括重组耻垢分枝杆菌与 BCG 感染巨噬细胞；体内为 SPF 级 C57BL/6 小鼠气溶胶感染约 200 CFU 的队列，于 30 天评估肺菌载、H&E 与抗酸染色病理。
研究结果方面，EspF promotes NLRP3 inflammasome activation and pyroptosis：研究人员将 11 种 ESX-1 效应蛋白与 NLRP3、ASC、pro-caspase-1、pro-IL-1β 共转 HEK293T，以上清 IL-1β 为指标，发现 EspF 激活最强；Mtb、M. bovis 与 M. marinum 的 EspF 序列高度保守且均促激活；在 DOX 诱导 THP-1-EspF 巨噬细胞中，LPS 加 nigericin 刺激才显著增强 IL-1β、IL-18、caspase-1 活化、ASC 斑点、GSDMD 裂解与 LDH 释放，说明 EspF 是已启动 NLRP3 信号的放大效应子。
EspF augments NLRP3 inflammasome activation during mycobacterial infection：构建过表达 EspF 的 M. smegmatis（Ms_EspF）与 BCG（BCG_EspF），亚细胞分级证明 EspF 转位至宿主胞质；感染 THP-1 后 IL-1β、caspase-1 活化、GSDMD 裂解、LDH 释放与 ASC 寡聚均高于空载体，且在 NLRP3 缺陷细胞中全部消失，证实 EspF 依赖 NLRP3 增强感染期炎症小体激活与焦亡。
EspF interacts directly with the NACHT and LRR domains of NLRP3：Co-IP 显示 EspF 只与 NLRP3 结合而不结合 ASC 或 pro-caspase-1；体外 pull-down 证直接结合；共聚焦显示胞质共定位；结构域作图表明 EspF 结合 NLRP3 的 NACHT（220-536）与 LRR（742-991）而非 PYD（1-93）。
TRIM25 is indispensable for EspF-induced NLRP3 inflammasome activation：LC-MS/MS 筛得 TRIM25 为高置信互作者；Co-IP、共聚焦与 pull-down 证 EspF–TRIM25 直接结合；在 THP-1-EspF 中用 siRNA 敲低 TRIM25 后，LPS 加 nigericin 诱导的 IL-1β 分泌、caspase-1 活化、GSDMD 裂解与细胞死亡均被削弱，表明 TRIM25 为必需宿主因子。
EspF recruits TRIM25 to promote K63-linked NLRP3 ubiquitination：Co-IP 与 pull-down 证 TRIM25 直接结合 NLRP3 的 NACHT/LRR；EspF 剂量增加可增强 TRIM25–NLRP3 结合；内源 THP-1 模型与 PLA 在 Ms_EspF 感染中均显示 TRIM25–NLRP3 邻近信号增多；CRISPR 敲除 TRIM25 的 HEK293T 中，EspF 促 NLRP3 总泛素化与 K63-only 泛素化均消失，证明 EspF 支架作用促成 TRIM25 介导的 NLRP3 K63 连接泛素化。
EspF promotes mycobacteria survival in vivo：C57BL/6 小鼠气溶胶感染 BCG_EspF 或 BCG_Vec 各约 200 CFU，30 天后 BCG_EspF 组肺大体病变更重，H&E 示炎症面积增加，肺组织 GSDMD 裂解增强，肺匀浆 7H10 平板计数菌载更高，抗酸染色见更多抗酸杆菌，说明 EspF 促体内分枝杆菌定植、播散与肺病理损伤。
讨论部分总结方面，研究人员指出 ESX-1 胞质进入是分枝杆菌炎症小体激活核心，EsxA 之外仍有其他效应子；EspF 是主导性 NLRP3 激活因子，其结合 NACHT/LRR 与 PPE13 策略相似，可能稳定 NLRP3 开放构象。NLRP3 受泛素化等翻译后修饰调控，TRIM25 既往以抗病毒 RIG-I 通路闻名，本研究揭示其细菌感控中正调 NLRP3：EspF 作支架招募 TRIM25 行 K63 连接泛素化。TRIM 家族成员可双向调控 NLRP3，说明该轴非孤立。体内 EspF 致过度炎症虽 IL-1 信号抗 TB，但焦亡与组织损伤反成利于菌存的炎症生态位；研究用重组 BCG 而非毒力 Mtb，EspF 在潜伏与复发期作用待考。
研究结论部分翻译：综上所述，研究人员鉴定 EspF 为一种新颖且保守的 ESX-1 效应蛋白，其通过 TRIM25 依赖机制直接靶向 NLRP3 炎症小体。结合既往其他分枝杆菌炎症小体调节效应蛋白研究，本发现支持这样一种模型：致病分枝杆菌部署机制多样的策路来精细调节炎症小体信号，使之走向有利于持久感染与病理的结果。这些见解深化了对分枝杆菌毒力机制的理解，并凸显包括 EspF–TRIM25–NLRP3 轴在内的炎症小体调节节点，可作为结核病宿主导向治疗的潜在靶点。
