蛋白酶体在红细胞储存期间及输血后维护红细胞完整性

《Antioxidants》：The Proteasome Safeguards Red Blood Cell Integrity During Storage and After Transfusion

　　

输血前红细胞（RBC）浓缩物冷藏储存会诱导由代谢和氧化应激驱动的体外衰老，限制输血效能。与其他有核细胞中多种衰老标志不同，在无核红细胞中，蛋白稳态（proteostasis）预期发挥主要作用，包括蛋白酶体（proteasome）蛋白降解。尽管蛋白酶体活性在体外衰老过程中下降，但其在产生下游改变和输血后清除中的作用仍不清楚。研究人员假设，蛋白酶体抑制会加速红细胞体外衰老，尤其是在重新暴露于生理条件后。研究人员评估了蛋白酶体抑制（即epoxomicin）对储存期间及体外生理恢复（physiological restoration）中红细胞质量的影响。此外，还比较了年轻与年老红细胞亚群。储存期间的蛋白酶体抑制耗竭ATP并改变红细胞形态，但未造成即时氧化损伤。对蛋白酶体受抑红细胞进行生理恢复，引起加速ATP耗竭、大量蛋白聚集、变形性下降、溶血以及磷脂酰丝氨酸（PS）暴露，在长期储存红细胞中尤为显著。引人注目的是，体内衰老的红细胞也表现出低蛋白酶体活性，并在生理恢复后表现与储存红细胞相似。总之，蛋白酶体功能障碍是红细胞衰老与衰老化（senescence）的关键标志，驱动分子和细胞改变，使红细胞在体内的清除中被标记。因此，增强蛋白酶体功能可改善红细胞储存质量与输血效能。

《Antioxidants》刊发的该研究围绕红细胞浓缩物冷藏储存导致的“储存损伤（storage lesion）”问题展开。目前，全球每年约生产1亿单位红细胞浓缩物，虽采用SAGM、AS-1等添加液可保存至42天，但红细胞在4℃下仍持续发生能量代谢下降、抗氧化能力降低、氧化应激升高，出现PS暴露、变形性降低、形态改变与溶血，输血后易发生内皮黏附、脾脏滞留、血管内或血管外溶血、组织氧合受损，降低输血恢复率与效能。由于成熟红细胞无核、无新蛋白合成、无溶酶体，其蛋白稳态网络仅剩分子伴侣修复与蛋白酶体降解系统；蛋白酶体活性随储存下降，但是否因果性驱动代谢、氧化及细胞改变并决定输血后清除尚不明。为弥补这一机制空白，研究人员以epoxomicin不可逆抑制蛋白酶体，在储存期与模拟输血后环境的生理恢复模型中表征红细胞，并比较密度梯度分离的年轻与年老红细胞亚群，从而判断蛋白稳态功能障碍是否为红细胞衰老的核心标志。

作者为开展研究用到几个主要关键技术方法：样本来自法国Etablissement Fran?ais du Sang及瑞士Transfusion Interrégionale CRS的健康供者红细胞浓缩物；以Percoll密度梯度（ρ=1.092 g/mL）分离年轻与年老红细胞亚群；用Proteasome-Glo^TM检测胰凝乳样、胰蛋白样、半胱天冬酶样三种蛋白酶体活性；以生理恢复模型（37℃、AB型血浆、5%或10%压积）模拟输血后环境；通过成像流式细胞术分析储存微红细胞（SME）与CFSE^high亚群；以CellTrace^TM Yellow（CTY）标记蛋白富集区、Proteostat检测蛋白聚集体、亮甲酚蓝染Heinz小体；UHPLC-MS/MS氧化还原蛋白质组学分析泛素化Gly-Gly残基及半胱氨酸单氧化、二氧化、谷胱甘肽化等修饰；用乳酸黏蛋白（lactadherin）测PS暴露，ektacytometry测变形性，Harboe法测溶血，流式定量乳黏蛋白/GPA双阳性细胞外囊泡（EV），HPLC测氧化血红蛋白P3峰。

3.1 蛋白酶体抑制在储存期加剧特定形态与代谢损伤

通过对10份浓缩物分袋给予epoxomicin或DMSO对照，在7、28、42天检测发现：抑制主要显著降低ATP（μ_mol/g Hb），长期储存下降23.4%，但不立即改变CTY点、Proteostat点、Heinz小体或氧化血红蛋白；形态上SME与CFSE^high红细胞增加，溶血、PS、EV与变形性在4℃下未明显恶化。结论：储存期蛋白酶体功能障碍首先表现为能量失衡与形态偏移，而非即时氧化蛋白损伤。

3.2 蛋白酶体抑制损害生理恢复模型中的红细胞命运

将短期与长期储存红细胞置入血浆37℃恢复模型：对照组ATP先升后降，长期红细胞CTY点显著增加；epoxomicin组短期ATP恢复被截断，长期ATP降至1.75 μ_mol/g Hb，CTY点达80%，Heinz小体、泛素K48/K11 Gly-Gly残基累积。细胞层面，长期受抑红细胞变形性进一步下降，溶血增36.5%，EV增151%，PS⁺细胞增66.5%。结论：生理恢复揭露出冷藏期不可见的潜伏损伤，蛋白酶体失能令长期储存红细胞获得衰老清除表型。

3.3 体内衰老老红细胞具有与蛋白酶体抑制红细胞相似属性

密度分选显示：第6天老红细胞平均 corpuscular体积（MCV）更小、蛋白酶体活性更低、变形性差但ATP相近；生理恢复中老红细胞无法像年轻细胞那样上调蛋白酶体活性，42天后老红细胞变形性丧失与溶血加重。结论：体内衰老本身伴随低蛋白酶体活性，其生理恢复表现与药理性抑制红细胞一致，证实蛋白稳态障碍是体外与体内红细胞衰老的共同标志。

讨论部分总结：研究人员指出，冷藏期蛋白酶体抑制未立刻引发氧化/聚集体标志，但因20S催化被抑而上游ATP依赖的泛素化、分子伴侣HSP60/HSP70/HSP90、离子泵仍耗能，形成“代谢漏损”致ATP耗竭；生理恢复后K48/K11多聚泛素链累积反映蛋白酶体拥堵，CTY点似液相分离质量控制器件，Proteostat点似aggresome，Heinz小体为变性血红蛋白沉积；聚集体又可物理堵塞20S通道，形成“聚集—蛋白酶体失能”恶性循环。老红细胞在献血压片时已低蛋白酶体活性，体外储存后与SME群体重合，解释输血后快速脾清除。研究局限包括小袋高质红细胞可能低估抑制效应、蛋白质组供者变异大、生理恢复模型缺乏内皮与网状内皮清除。临床意义上，增强泛素–蛋白酶体系统可降SME比例，对镰状细胞病、骨髓增生异常综合征慢性输血及β-地中海贫血具潜在价值。

结论部分翻译：总之，本研究阐明了成熟红细胞在蛋白酶体抑制导致蛋白稳态功能障碍后所经历的级联事件：从造成细胞改变的分子损伤，到最终出现清除易感表型。研究人员提出，蛋白稳态功能障碍可能与氧化和代谢改变并列，作为第三类关键分子改变，驱动造成红细胞储存损伤并降低输血效能的细胞变化。本研究还凸显了蛋白酶体在维持红细胞衰老期稳态中的核心作用，无论是在4℃体外储存还是体内循环。蛋白酶体效率决定了红细胞处理很可能由氧化应激导致的蛋白损伤的能力，这在红细胞体内衰老或长期冷藏时尤为关键。研究人员假设，蛋白聚集体作为蛋白酶体堵塞的症状和原因，驱动红细胞出泡与清除的退化级联。未来研究应探索增强蛋白稳态功能能否改善冷藏红细胞浓缩物储存质量与输血效能，并减缓血红蛋白病患者的体内红细胞早老。

研究重要意义在于：把“蛋白稳态失效”从伴随现象提升为红细胞储存损伤与体内衰老的因果性标志，为以蛋白酶体激活、聚集体防控而非仅抗氧化或补代谢的输血医学新策略提供机制依据。