小鼠肝转移而非肺转移三阴性乳腺癌细胞的体外谷氨酰胺适应性

《Cells》：In Vitro Glutamine Adaptability in Murine Liver- but Not Lung-Metastasizing Triple-Negative Breast Cancer Cells

　　

背景：代谢适应性在支持转移性乳腺癌细胞生长和存活中发挥关键作用，并可能支持位点特异性转移。本研究探讨了转移至肺（metM-WntLung）或肝（metM-WntLiver）的三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）细胞对谷氨酰胺的差异代谢及对不同谷氨酰胺水平的适应性。方法：将转移性细胞系暴露于不同体外谷氨酰胺浓度（0.5、2和4 mM）。检测细胞活力、迁移、¹⁴C-谷氨酰胺摄取、代谢酶mRNA丰度以及¹³C₅-谷氨酰胺细胞通量。结果：在中等水平体外谷氨酰胺补充（2 mM）下，与metM-WntLiver细胞相比，metM-WntLung细胞表现出更高的谷氨酰胺摄取、分解代谢酶表达以及谷氨酰胺来源碳进入三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环的通量。尽管如此，在较高（4 mM）和较低（0.5 mM）谷氨酰胺水平下，metM-WntLiver细胞的活力和迁移能力均高于metM-WntLung细胞，提示其具有代谢适应性。暴露于氨可上调metM-WntLiver细胞中的氨同化酶，而metM-WntLung细胞中未见上调，这可能减轻高谷氨酰胺条件下的氨毒性。在谷氨酰胺剥夺条件下，metM-WntLung细胞维持较高的谷氨酰胺氧化，但metM-WntLiver细胞具有更高的总谷胱甘肽及GSH/GSSG比值，并增强了对氧化应激的抵抗能力，提示谷氨酸被用于谷胱甘肽合成。此外，metM-WntLiver细胞通过丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC）利用葡萄糖来源碳维持TCA循环活性，其PC表达和M+3标记草酰乙酸富集程度均高于metM-WntLung细胞。在metM-WntLiver细胞中沉默PC可增强谷氨酰胺剥夺下的细胞活力，而抑制磷酸甘油酸脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH，丝氨酸从头合成的关键酶）可逆转这一效应。研究人员提出，PC活性可补偿低谷氨酰胺水平，包括将葡萄糖转向适应性途径（如丝氨酸从头合成）。结论：总体而言，研究结果表明，metM-WntLiver细胞而非metM-WntLung细胞表现出谷氨酰胺特异性代谢可塑性，其特征为调节谷氨酰胺分解代谢、增强氨代谢和抗氧化防御，并支持葡萄糖代谢，这些特征与谷氨酰胺过量及剥夺条件下更好的细胞存活和迁移相关。

论文解读：肝转移倾向的三阴性乳腺癌细胞表现出谷氨酰胺特异性代谢可塑性

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，转移是导致患者死亡的主要原因。三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）作为一种侵袭性强、预后较差的亚型，具有高频率的肺转移（约45%）和肝转移（约40%）倾向。肿瘤细胞能否成功转移至特定器官，在很大程度上取决于其代谢适应靶器官独特营养环境的能力。肺和肝脏具有截然不同的谷氨酰胺代谢特征，而谷氨酰胺是体内最丰富的氨基酸，不仅为肿瘤生长提供碳源和还原氮，还参与三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环回补、谷胱甘肽合成及免疫调节。既往研究表明TNBC细胞对谷氨酰胺具有高度依赖性，但部分细胞可通过代谢重编程抵抗谷氨酰胺靶向治疗。然而，具有肺或肝转移倾向的TNBC细胞如何适应不同谷氨酰胺水平，其机制尚不清楚。为此，研究人员利用前期构建的分别优先转移至肺（metM-WntLung）或肝（metM-WntLiver）的小鼠TNBC细胞系，系统比较了它们在体外不同谷氨酰胺浓度（0.5、2和4 mM）下的代谢应答与适应能力。该研究发表于《Cells》。

在技术方法上，研究人员主要采用了以下手段：将两种转移倾向的TNBC细胞暴露于不同谷氨酰胺浓度，通过MTT法和台盼蓝排斥实验检测细胞活力，用Transwell实验评估迁移能力；利用¹⁴C-谷氨酰胺示踪测定细胞摄取；采用qRT-PCR检测谷氨酰胺代谢相关酶的mRNA丰度；运用¹³C₅-谷氨酰胺和¹³C₆-葡萄糖稳定同位素示踪结合气相色谱-质谱联用（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）分析代谢通量；并检测氨含量、总谷胱甘肽及GSH/GSSG比值。此外，还使用了谷氨酰胺酶抑制剂968、组成型沉默丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，PC）以及磷酸甘油酸脱氢酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）抑制剂NCT-503进行功能干预。所有细胞系均为小鼠来源的转移性TNBC细胞模型，非患者队列样本。

研究结果分为六个部分。第一，肺转移和肝转移乳腺癌细胞差异代谢谷氨酰胺。在2 mM谷氨酰胺条件下，研究人员发现metM-WntLung细胞的¹⁴C-谷氨酰胺摄取比metM-WntLiver细胞高26%，且谷氨酰胺分解酶谷氨酰胺酶2（glutaminase 2，GLS2）和谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GLUD）的mRNA丰度更高；¹³C₅-谷氨酰胺示踪显示，metM-WntLung细胞中M+5标记谷氨酸、M+4标记富马酸和M+4标记苹果酸的富集显著高于metM-WntLiver细胞，表明肺转移倾向细胞具有更强的谷氨酰胺摄取、分解及进入TCA循环的通量。第二，肝转移TNBC细胞比肺转移TNBC细胞对高谷氨酰胺更具适应性。在4 mM高谷氨酰胺处理48小时后，metM-WntLiver细胞活力较2 mM时显著增加18%，而metM-WntLung细胞无显著变化；台盼蓝计数也显示metM-WntLiver增殖率（99.1%）高于metM-WntLung（90.8%）。在低葡萄糖（1 mM或0 mM）联合高谷氨酰胺条件下，metM-WntLiver细胞仍保持较高活力，且其迁移能力更强。第三，肝转移TNBC细胞而非肺转移细胞利用氨并对高谷氨酰胺下氨毒性更具抵抗力。在5 mM NH₄Cl处理后，metM-WntLiver细胞活力较metM-WntLung高8.5%；氨暴露上调了metM-WntLiver细胞中氨同化相关酶氨基甲酰磷酸合成酶2（carbamoyl-phosphate synthetase 2，CAD）和天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）的mRNA水平，而metM-WntLung细胞未见上调。在高谷氨酰胺条件下，metM-WntLiver细胞培养上清中胞外氨浓度（222.0±4.6 nmoles/mL）显著低于metM-WntLung细胞（250.2±2.9 nmoles/mL），提示其通过氨同化减轻氨毒性。第四，肝转移TNBC细胞比肺转移TNBC细胞对低谷氨酰胺更具适应性。在0.5 mM谷氨酰胺或谷氨酰胺酶抑制剂GLS-968处理条件下，metM-WntLiver细胞的活力、增殖和迁移均高于metM-WntLung细胞；¹⁴C-谷氨酰胺摄取和¹³C₅-谷氨酰胺通量分析显示，metM-WntLiver细胞更大幅度地减少了谷氨酰胺向TCA循环的流入，M+4标记富马酸、M+4标记草酰乙酸及M+5标记柠檬酸的富集均显著低于metM-WntLung细胞，提示其通过降低谷氨酰胺氧化适应剥夺环境。第五，肝转移TNBC细胞而非肺转移细胞在低谷氨酰胺下利用谷氨酰胺合成谷胱甘肽。在0.5 mM谷氨酰胺条件下，metM-WntLiver细胞的总谷胱甘肽含量和GSH/GSSG比值更高，且在H₂O₂诱导的氧化应激下活力更高；重新补充2 mM谷氨酰胺可显著恢复metM-WntLiver细胞的谷胱甘肽水平和抗氧化能力。外源性补充谷胱甘肽（0.5和1 mM）对metM-WntLung细胞的活力及迁移挽救更明显，提示metM-WntLiver细胞更依赖内源性谷氨酰胺驱动谷胱甘肽合成来抵抗氧化应激。第六，肝转移TNBC细胞而非肺转移细胞在低谷氨酰胺下利用葡萄糖支持活力。在¹³C₅-谷氨酰胺示踪中，metM-WntLiver细胞未标记（M+0）草酰乙酸池显著更高，提示PC介导的葡萄糖回补增强；其PC mRNA水平在低谷氨酰胺下更高，且在无谷氨酰胺条件下补充25 mM葡萄糖时活力更高。然而，组成型沉默PC（shPC）后，metM-WntLiver细胞在低谷氨酰胺下的活力反而增强，而抑制PHGDH（丝氨酸从头合成关键酶）可逆转这种增强，提示在PC受损时葡萄糖碳可能转向丝氨酸从头合成以维持适应。

在讨论部分，研究人员指出，metM-WntLung细胞虽然具有更高的谷氨酰胺分解通量，但这也使其更容易受到氨等代谢废物的毒性影响；而metM-WntLiver细胞通过上调氨同化酶（如ASNS和CAD）将氨重新同化入氨基酸代谢，这可能与肝转移倾向相关。此外，metM-WntLiver细胞在谷氨酰胺剥夺时将谷氨酰胺来源的谷氨酸用于谷胱甘肽合成，并通过PC介导的葡萄糖回补维持TCA循环，甚至可启动丝氨酸从头合成以适应代谢压力。研究结论部分指出，metM-WntLiver细胞而非metM-WntLung细胞表现出谷氨酰胺特异性代谢可塑性，其特征为高谷氨酰胺条件下上调氨利用酶、低谷氨酰胺条件下利用谷氨酰胺合成谷胱甘肽并通过PC支持葡萄糖来源的回补及适应性途径，从而维持更好的细胞存活和迁移。相反，metM-WntLung细胞更依赖外源谷氨酰胺，因而对谷氨酰胺剥夺更敏感，且难以适应谷氨酰胺过量。该研究揭示了转移性TNBC细胞的代谢异质性，并强调谷氨酰胺代谢在位点特异性适应中的潜在作用；同时提示，同时靶向葡萄糖和谷氨酰胺代谢可能是限制TNBC肺和肝转移的潜在治疗策略。