《International Journal of Molecular Sciences》：Docosahexaenoic Acid Enhances the Cytotoxic Effects of Enzalutamide and the PARP Inhibitor in Castration-Resistant Prostate Cancer Cell Lines
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二十二碳六烯酸（DHA），一种ω-3脂肪酸，已成为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的一种有前景的辅助治疗手段，但其与当前疗法的相互作用仍不清楚。本研究在CRPC细胞系22Rv1和PC3中探讨了DHA单独或与恩扎卢胺（ENZ）或PARP抑制剂AZD2461（iP）
二十二碳六烯酸（DHA），一种ω-3脂肪酸，已成为去势抵抗性前列腺癌（CRPC）的一种有前景的辅助治疗手段，但其与当前疗法的相互作用仍不清楚。本研究在CRPC细胞系22Rv1和PC3中探讨了DHA单独或与恩扎卢胺（ENZ）或PARP抑制剂AZD2461（iP）联合的抗肿瘤作用。DHA增强了iP在两种细胞系中的细胞毒性作用，并增强了ENZ在22Rv1细胞中的细胞毒性作用。在PC3细胞中，DHA介导的iP细胞毒性增强与AKT通路下调、ERα及脂质传感器PPARγ和LXRβ表达降低，以及程序性细胞死亡向坏死性凋亡的转变相关。在22Rv1细胞中，DHA与ENZ或iP的叠加效应不依赖于PI3K/pAKT和AR-FL/AR-V7的调节，但与LXRβ、PPARγ和TNFR1的调控以及凋亡的激活相关。伤口愈合实验表明，DHA阻断了ENZ和iP在22Rv1细胞中的抗迁移作用，且未改变iP在PC3细胞中的作用，提示存在上皮-间质转化异质性。总体而言，DHA通过分子背景依赖性的细胞死亡差异调节，增强了iP在两种模型中的细胞毒性作用，并增强了ENZ在22Rv1细胞中的细胞毒性作用。
论文解读
**研究背景与目的**
前列腺癌（PCa）是全球男性常见恶性肿瘤，其发生发展与饮食因素密切相关。典型的西方饮食模式中ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFAs）摄入减少，而饱和脂肪酸（SFAs）和ω-6 PUFAs增加，这被认为是东西方PCa发病率差异的重要原因之一。去势抵抗性前列腺癌（CRPC）是PCa的终末阶段，患者即使接受雄激素剥夺治疗（ADT）后疾病仍进展，预后极差，中位总生存期短。CRPC的耐药机制包括雄激素受体（AR）依赖性通路，如AR基因扩增、AR剪接变异体（如AR-V7）表达，以及AR非依赖性机制，如PI3K/AKT/mTOR通路激活、糖皮质激素受体（GR）代偿等。
新一代雄激素受体信号抑制剂（ARSIs）恩扎卢胺（ENZ）和聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂（PARPi）改善了CRPC患者的治疗选择。然而，ENZ的疗效常因AR-V7的出现等因素而受限；PARPi虽在携带同源重组修复（HRR）基因突变的患者中有效，但耐药问题依然存在。AZD2461作为新一代PARPi，对P-糖蛋白外排泵的敏感性较低，可能克服部分耐药。因此，寻找能增强现有药物疗效、克服耐药的新策略具有重要意义。
二十二碳六烯酸（DHA）是一种ω-3脂肪酸，具有多种抗肿瘤特性，包括诱导细胞凋亡、调节脂质代谢、抑制增殖等，并可能通过调节非经典细胞死亡通路（如坏死性凋亡和焦亡）增强抗肿瘤效果。研究人员假设DHA与ENZ或PARPi联合使用，可能通过药物本身不涉及的不同机制增强对去势抵抗性细胞的细胞毒性。该研究旨在评估DHA单独及联合ENZ和PARP抑制剂AZD2461在CRPC细胞系22Rv1和PC3中的抗肿瘤作用，探讨细胞死亡诱导机制及联合治疗的潜在协同效应。相关研究成果发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
**关键技术与方法**
研究人员采用多种实验方法，包括MTS实验检测线粒体代谢率（MMR），台盼蓝排斥实验和DAPI核染色自动计数评估细胞活力与增殖，结晶紫染色克隆形成实验评估长期克隆原代生存能力，划痕实验评估细胞迁移能力，免疫荧光检测LC3B和BCL2表达，荧光法检测caspase-3活性，以及蛋白质印迹（Western blotting）分析多种信号通路蛋白表达。实验所用的22Rv1细胞（#CRL-2505）和PC3细胞（#CRL-1435）均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。
**主要研究结果**
**DHA增强iP诱导的线粒体代谢率降低且具有细胞系特异性。** MTS实验结果显示，在22Rv1细胞中，DHA联合ENZ或iP未进一步降低MMR；而在PC3细胞中，DHA与iP联合显著增强了iP诱导的MMR降低，表现为叠加效应。基于此，后续实验选用20 μM iP和30 μM ENZ处理48小时。
**DHA增强ENZ和iP的细胞毒性。** 台盼蓝排斥实验和DAPI核计数显示，在22Rv1细胞中，DHA联合ENZ显著降低细胞活力至72%，DHA联合iP显著降低细胞数量；在PC3细胞中，DHA+iP协同降低细胞数量达49%。
**DHA增强PC3细胞中iP诱导的AKT通路抑制。** Western blotting结果显示，所有处理均降低两种细胞系中PI3K和pAKT水平。在PC3细胞中，DHA+iP组的pAKT水平较iP单药显著降低，而22Rv1细胞中各联合组无显著差异。此外，iP单药或联合DHA可升高22Rv1细胞中pERK1/2水平，PC3细胞中仅DHA+iP组升高。
**DHA降低AR-FL但未影响22Rv1细胞中的AR-V7。** 在22Rv1细胞中，所有处理均显著降低AR-FL表达，ENZ和DHA+ENZ组降幅最大（99%和92%）。DHA单药不改变AR-V7表达，但其他处理均降低其表达，以ENZ组最明显。
**ENZ和iP降低两种细胞系的GRα/ERα表达，DHA增强PC3细胞中ERα的下调。** 所有处理均降低22Rv1细胞的GRα和GRβ表达；PC3细胞中GRα降低，但DHA使GRβ升高40%。ERα在两种细胞系中均被显著抑制，其中PC3细胞DHA+iP组的ERα较iP单药进一步降低96%。
**DHA显著抑制克隆形成能力。** 克隆形成实验中，DHA单药使22Rv1细胞克隆面积减少96%，PC3细胞完全抑制克隆形成。DHA+ENZ和DHA+iP联合组的克隆面积分别减少98%和95%，与DHA单药效果相似，且克隆强度下降。
**DHA在ENZ和iP处理下影响22Rv1细胞的EMT和迁移，PC3细胞中表现不同。** 划痕实验中，22Rv1细胞单药处理均显著抑制迁移（19%-20%闭合），而DHA+ENZ和DHA+iP联合组与对照组无差异，显示DHA阻断了药物的抗迁移作用。PC3细胞中，iP单药和DHA+iP延缓伤口闭合。EMT标志物分析显示，22Rv1细胞中DHA+ENZ组E-cadherin较对照组升高4.1倍，且DHA+iP组vimentin降低67%；PC3细胞中iP单药及联合组vimentin表达降低。
**DHA通过PPARγ和mTOR信号调节LC3B积累。** 免疫荧光显示，22Rv1细胞所有处理均增加LC3B信号，但DHA+ENZ较ENZ单药降低，提示DHA减弱ENZ诱导的LC3B积累。PC3细胞中，DHA和iP单药分别使LC3B荧光升高148%和73%，但联合组恢复至对照水平。Western blotting显示，PC3细胞中DHA+iP组PPARγ较iP单药降低约89%，pmTOR较对照降低78%。
**治疗通过细胞系依赖性机制诱导细胞凋亡。** 22Rv1细胞中所有处理均升高活性caspase-3水平，DHA+iP增强iP诱导的cPARP表达约2倍。PC3细胞凋亡反应较弱，DHA+iP虽升高caspase-3活性，但cPARP较iP单药降低59%，提示非经典凋亡机制。BCL2在22Rv1细胞中DHA+iP组较iP升高45%，PC3细胞中所有处理均降低其表达。
**DHA在PC3细胞中触发焦亡并增强iP诱导的坏死性凋亡。** 22Rv1细胞中ENZ诱导pMLKL升高141%（促坏死性凋亡），但DHA+ENZ使其降低2.2倍，转向凋亡。PC3细胞中所有处理均升高pMLKL，DHA+iP呈叠加效应；DHA和DHA+iP组cGSDMD较对照升高38%和33%，激活焦亡。
**DHA提高两种细胞系TNFR1表达。** 两种细胞系中DHA相关处理均升高TNFR1水平，22Rv1细胞DHA+ENZ组较ENZ单药进一步升高。LXRβ在22Rv1细胞中被药物单独或联合DHA抑制，DHA+ENZ较ENZ降低3.4倍；PC3细胞中DHA+iP使LXRβ较对照降低71%。
**iP不影响22Rv1细胞的NF-κB但与DHA在PC3细胞中协同降低其表达。** 22Rv1细胞中DHA、ENZ和DHA+ENZ分别使NF-κB降低28%、73%和55%，iP无作用。PC3细胞中仅DHA+iP使NF-κB降低24%，较单药低约1.4倍。
**讨论与结论**
讨论指出，DHA与iP的联合在PC3细胞中产生叠加细胞毒效应，涉及AKT通路抑制、pmTOR降低、ERα及核受体PPARγ/LXRβ下调，以及坏死性凋亡的增强。DHA还重塑了细胞死亡模式，在22Rv1细胞中增强凋亡，在PC3细胞中促进坏死性凋亡，并伴随TNFR1上调。研究还观察到DHA对LXRβ的调节可能与抑制EMT和转移有关。这些发现表明DHA可作为一种多功能代谢与信号调节剂，通过多种机制增强现有药物的抗肿瘤作用，为CRPC的联合治疗提供了新思路。研究结论强调，DHA在CRPC细胞模型中作为单药具有显著抗肿瘤效应，并可作为辅助策略，但其与ENZ和PARP抑制剂AZD2461的相互作用复杂且高度依赖分子背景。在AR阴性的PC3细胞中，DHA+iP联合是一种合理策略，可同时激活坏死性凋亡和焦亡，增强免疫原性细胞死亡，可能促进体内抗肿瘤免疫应答。在AR阳性的22Rv1细胞中，DHA联合ENZ或iP同样增强细胞毒性，但涉及迁移和EMT异质性等复杂效应。后续研究需在更多CRPC模型和体内实验中验证这些联合方案的临床转化潜力。
