《International Journal of Molecular Sciences》：Explainable Artificial Intelligence and Gene-Network Analysis Prioritise a TREM2/LGALS3/GPNMB Scar-Associated Macrophage Programme in Human Liver Cirrhosis
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巨噬细胞组织肝硬化纤维化微环境。瘢痕相关巨噬细胞状态已被较好描述，但其定义性基因很少以无偏倚、基于模型的方式排序，此类重新分析的统计局限也鲜有报告。研究人员旨在从无监督方式重新推导瘢痕相关巨噬细胞程序，按汇聚计算证据对其组成基因排序，并明确说明该规模队列能支持
巨噬细胞组织肝硬化纤维化微环境。瘢痕相关巨噬细胞状态已被较好描述，但其定义性基因很少以无偏倚、基于模型的方式排序，此类重新分析的统计局限也鲜有报告。研究人员旨在从无监督方式重新推导瘢痕相关巨噬细胞程序，按汇聚计算证据对其组成基因排序，并明确说明该规模队列能支持与不能支持的结论。研究人员重新分析了来自5个未损伤与5个肝硬化人类肝脏的58,358个单细胞转录组（GEO GSE136103；Edinburgh DataShare DS_10283_3433）。经质量控制、Harmony批次整合与Leiden聚类后，对单核吞噬细胞区室（9869个细胞）再聚类。研究人员采用供体水平组成检验（在CD45+/CD45?分选 fraction 内分层）、供体水平伪批量差异表达、三种分类器并在供体分组交叉验证下使用SHapley Additive exPlanations（SHAP）、转录因子差异表达、扩散伪时间、配体—受体建模与CellOracle计算机内扰动；所有条件比较以供体而非细胞为分析单位。一个离散巨噬细胞簇（390个细胞；60.5%为肝硬化；由全部10名供体贡献）携带由LGALS3、GPNMB、TREM2、CD9、FABP5、APOE、APOC1与CTSD组成的连贯脂质/瘢痕程序，并在测试的全部22种聚类配置中被恢复。整合优先级具有稳健性：1000次Dirichlet重加权中，7个基因在100%情况下留在前20。MAFB、MITF与TFEC为显著富集转录因子，伪时间将该状态置于单核细胞根下游。三项发现弱化结果：多重检验校正后无任何谱系显示组成显著变化，且每项检验对观测效应均效能不足；供体水平伪批量差异表达无基因达显著；分类器0.99性能反映预测由同一矩阵定义的簇的循环性，非循环的细胞学对照为0.61–0.65。总体而言，有完整可重复框架重新推导并排序TREM2/LGALS3/GPNMB瘢痕相关巨噬细胞程序，并将galectin-3、GPNMB与SPP1轴列为优先但临床未证实的候选；该优先级是需独立、空间、蛋白水平与功能验证的假设。
研究背景方面，慢性肝病是全球死亡增长最快的成因之一，肝硬化作为其共同终点仍缺乏可可靠逆转已形成的瘢痕的治疗手段。纤维化是可消退的细胞外基质过量沉积，而肝硬化出现间隔桥接、再生结节与血管重塑后逆转不确定并继发门静脉高压。病理上，肝细胞损伤后炎症浸润、肝星状细胞向肌成纤维细胞转分化、Disse间隙Ⅰ/Ⅲ型胶原堆积、窦状隙毛细血管化、导管反应与血管分流导致实质消亡。巨噬细胞位于该过程中心，单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）已解析肝脏髓系区室为驻留Kupffer细胞与招募的单核细胞衍生群体，并确立一种积聚于肝硬化纤维间隔的瘢痕相关巨噬细胞（scar-associated macrophage，SAM）。脂肪组织与脂肪性肝炎中亦描述TREM2依赖的脂质相关巨噬细胞。该状态的存在与标志物组成已建立，但从描述状态到在状态内优先排序仍存在缺口：描述性标志物列表不能说明哪些基因最具特征性、哪些可能是调控因子、哪些应优先实验。可解释人工智能（explainable artificial intelligence，XAI）可通过正则化线性模型与树集成无假设学习区分细胞状态的特征，并用SHAP将贡献分配到单基因；基因调控网络（gene-regulatory network，GRN）推断则从启动子基序约束的共表达得到可计算机内扰动的调控关系。研究人员在《International Journal of Molecular Sciences》发表的工作，即把公开人类肝硬化图谱转为可排名、可归因候选列表的方法学框架，而非重新发现该巨噬细胞状态。
主要关键技术方法上，研究人员使用Ramachandran等公开人类肝脏scRNA-seq资源（GEO GSE136103；Edinburgh DataShare DS_10283_3433），含5个未损伤与5个肝硬化肝脏、58,358个质控后细胞。方法包括Harmony批次整合、Leiden聚类、供体水平组成与伪批量差异表达、供体分组交叉验证下三种分类器与SHAP归因、转录因子差异表达、扩散伪时间（diffusion pseudotime）、配体—受体建模、CellOracle计算机内转录因子网络扰动，并以Dirichlet重加权检验排名稳健性；分析单位始终为供体。
2.1. Cohort Composition and Its Statistical Limits：研究人员在CD45+与CD45?分选区室内按供体计算谱系比例，用Mann–Whitney U检验与Benjamini–Hochberg校正，并进行自助法置信区间、Cliff's δ与80%效能可检测最小差异计算。结论为24个谱系×区室比较校正后均无显著组成变化；单核吞噬细胞在CD45+中肝硬化0.147±0.057、未损伤0.192±0.141，差?0.045且效能不足，故只能说未检测到显著变化，不能断言丰度不变。
2.2. Myeloid Re-Clustering Recovers a Candidate Scar-Associated Macrophage：研究人员对9869个单核吞噬细胞再聚类得13个转录状态，其中一个簇（cluster 6，390细胞，60.5%肝硬化）瘢痕/脂质程序评分1.53，高于次高0.70。全部10名供体均有贡献；22种分辨率与图划分组合均恢复该程序高簇。结论为该簇是扩增而非疾病独有开启的程序，分辨率0.90处于簇数稳定平台中点。
2.3. The Programme Is Defined by Lipid and Lysosomal Genes：研究人员用one-versus-rest找簇定义标志，领先基因为LGALS3、GPNMB、APOC1、CTSD、FABP5、ACP5、LIPA、CYP27A1、APOE、CD9、TREM2、SPP1等脂质/溶酶体/基质基因。供体水平伪批量对比13,453个基因，校正后无基因显著；SPP1与TREM2等有大幅一致效应但转录组校正后不显著。细胞级伪复制会夸大显著性。因病因与疾病状态嵌套，无法作为协变量，留一病因敏感性分析显示效应非单一病因驱动。
2.4. Machine-Learning Attribution, and What Its Accuracy Does and Does Not Mean：三种分类器在簇对其余任务下供体分组交叉验证AUC 0.990，因标签来自同一表达矩阵聚类，属恢复分区而非疾病信号；改用肝硬化对未损伤细胞任务AUC降至0.605、0.653、0.635。按上调、SHAP与随机森林重要性百分位数等权合并，1000次Dirichlet重加权中LGALS3、GPNMB、APOC1、CTSD、FABP5、ACP5、OTOA在100%抽取中留前20。SHAP与随机森林重要性ρ=0.84，并非独立证据。
2.5. Candidate Regulators and Trajectory：在660个可测转录因子中，JUN、YBX1、ATF3、ZNF331与MAFB富集最前，MAFB调整后p=9.4×10?15；MiT/TFE成员MITF与TFEC也显著但排名较低。预指定负对照NR4A2不富集（rank 640/660）。扩散伪时间以单核细胞特征最高的簇为根，cluster 6位于根下游，支持单核细胞衍生但不等于谱系证明。
2.6. Predicted Communication, Computational Perturbation and Convergence：研究人员预测cluster 6向间充质细胞信号以SPP1轴（CD44、αv integrins）为主，TGFB1、IL1B、OSM有贡献；配体—受体共表达只是通信假设。CellOracle仅能扰动转录因子，故MITF、TFEC、MAFB、NR4A2可模拟，LGALS3/GPNMB/SPP1等效应基因不在模型中。模拟敲除中NR4A2使程序评分降最多（?0.107），MAFB次之（?0.076），MITF/TFEC几乎无影响。NR4A2被表达流拒绝却被网络扰动排第一，说明方法可不一致。LGALS3、GPNMB、APOC1、CTSD、FABP5同时在各流前百分位；模块评分显示纤维化与细胞外基质程序在间充质，巨噬细胞炎症与修复评分最高。
讨论部分总结：研究人员强调该框架重新推导并排序SAM程序，结论从属于Ramachandran等已建立的 descriptor 工作；与有实验操作的研究不同，本工作仅是单横断面队列的计算预测。组成分析未显著不等于丰度不变；galectin-3虽有实验性肝/肺纤维化促纤证据，但belapectin的2b期试验未达主要终点，因此计算优先不代表临床靶标成立。所有证据流共享同一数据集与预处理，错误相关，流间一致只能界定方法依赖性而非外推性；SHAP与随机森林不独立，NR4A2矛盾说明方法不可互换。局限包括无独立队列、5对5供体效能不足、无空间/蛋白/功能验证、CD45分选设计遗留、簇仅数百细胞、网络扰动限转录因子、无临床结局数据。建议用多重免疫染色、空间转录组、独立scRNA-seq队列与已有纤维模型中的galectin-3/osteopontin抑制及更大供体队列跟进。
结论部分翻译：无监督且完整记录的框架重新推导人类肝硬化中瘢痕相关巨噬细胞状态，并排序由LGALS3、GPNMB、TREM2、CD9、FABP5、APOE、APOC1与CTSD组成的脂质/溶酶体/基质程序，该优先级在1000次证据重加权下稳定。向间充质的预测通信以SPP1为主并在肝硬化中上升，而MAFB、JUN与MiT/TFE因子成为候选调控因子。这些是被预测而非被证明的关系：这个10名供体的队列未检测到显著组成变化，也无供体水平差异表达基因，且网络扰动不能处理该程序所含的效应基因。在galectin-3、GPNMB或SPP1轴被视为既定抗纤维化靶标之前，需要独立、空间、蛋白水平与功能验证。
