《International Journal of Molecular Sciences》：Artificial Intelligence-Based Prediction of Molecular Alterations in Colorectal Cancer Using Routine H&E Whole-Slide Images
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体外肠道模型如Caco-2细胞是药物代谢动力学研究的重要组成部分。然而昆虫肠道细胞在药物代谢动力学研究中较难处理，限制了研究人员对这类物种中农药药物代谢动力学的认识。为克服该问题，研究人员构建了经基因改造以表达昆虫P-糖蛋白（Pgp, P-glycoprote
体外肠道模型如Caco-2细胞是药物代谢动力学研究的重要组成部分。然而昆虫肠道细胞在药物代谢动力学研究中较难处理，限制了研究人员对这类物种中农药药物代谢动力学的认识。为克服该问题，研究人员构建了经基因改造以表达昆虫P-糖蛋白（Pgp, P-glycoprotein）的Caco-2细胞系，提供一个稳健的“昆虫化（insectified）”筛选平台来监测外源物转运。该平台由野生型（Pgpwild type）细胞、可消除内源性背景干扰的Pgp敲除（PgpKO）细胞系，以及可稳定表达人类（Hs Pgp）、棉铃虫（Ha Pgp）和疟蚊（Ag Pgp）同源蛋白的物种特异性Pgp回补细胞系组成，从而直接比较不同农药与物种间的外排动力学。使用底物地高辛（Digoxin）的功能验证证实该平台具有高Pgp依赖性。有机磷杀虫剂甲基对硫磷（methyl parathion）可被昆虫和人类对Pgp识别并转运，与该化合物较低的哺乳动物选择性一致。相比之下，三氟咪吡喃（Triflumezopyrim）表现出较高外排比，且在缺失MDR1时仍异常稳定，说明该化合物的摄取和药物代谢动力学不依赖Pgp。通过成功区分转运蛋白依赖与非依赖途径，这些细胞系可作为高保真筛选工具，用于预测新型农药选择性，并可能验证转运蛋白在抗性中的作用。未来工作可将该系统扩展至其他转运蛋白。
研究背景方面，肠道上皮是决定摄入性环境毒素包括现代杀虫剂药物代谢动力学与毒性的关键屏障。哺乳动物常用Caco-2细胞可形成极化单层和紧密连接，用于转运研究；而昆虫来源肠道细胞缺乏这种有序上皮结构、极化层与紧密连接，难以复现哺乳动物肠道的选择性通透和主动转运机制。膜转运蛋白尤其是ATP结合盒（ABC, ATP-binding cassette）与溶质载体（SLC, solute carrier）超家族，是介导杀虫剂穿越昆虫肠道和血脑屏障药物代谢动力学的重要守门者；其中P-糖蛋白（Pgp, MDR1/ABCB1）可在顶侧外排药物或外源物，降低敏感组织中毒素蓄积。Pgp同源物在害虫中肠与马氏管上调与对拟除虫菊酯和阿维菌素等耐受有关，因此亟需可跨物种比较农药生物利用度选择性的体外模型。研究人员由此构建“昆虫化”Caco-2平台，去除内源性Pgp后回补人类、棉铃虫和疟蚊Pgp同源蛋白，用以研究农药生物利用度选择性并验证Pgp基因在农药抗性中的角色。该论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。
主要关键技术方法方面，研究人员使用ATCC来源Caco-2细胞与Sigma-Aldrich来源Caco-2 MDR1敲除细胞作为基础模型；将合成的人类ABCB1、棉铃虫ABCB7、疟蚊ABCFB编码序列克隆至pcDNA3.1并稳定转染PgpKO细胞，经G418筛选单克隆建立回补细胞系。通过跨上皮电阻（TEER, transepithelial electrical resistance）与荧光黄（Lucifer yellow）评估单层屏障完整性，以罗丹明123（Rhod123）为Pgp荧光探针，维拉帕米（Verapamil）为Pgp抑制剂，在Transwell体系中开展双向转运实验计算表观渗透系数（Papp, apparent permeability coefficient）与外排比（ER, efflux ratio），并以高分辨轨道阱液相色谱质谱（LC/MS）定量地高辛、甲基对硫磷和三氟咪吡喃。
研究结果方面，2.1 验证Caco-2细胞系与渗透 assay 优化中，研究人员用C219抗体免疫荧光与Western blot确认PgpKO细胞无Pgp表达，PgpKO单层TEER高于野生型；优化显示Rhod123优于RhodB作为Pgp底物，14天高密度接种与21天常规培养外排表型一致，PgpKO近完全丧失Rhod123外排，维拉帕米可抑制野生型外排，证明平台背景干净、转运功能可靠。2.2 建立并表征稳定表达Ha Pgp、Ag Pgp与Hs Pgp的Caco-2细胞中，转染后经G418与单克隆筛选获得表达株，免疫荧光见Pgp定位于细胞周边、GFP报告蛋白泛在分布，Western blot在130至180 kDa区间检出预期分子量条带，HaPgp约139 kDa、AgPgp约142 kDa、HsPgp约148 kDa，并有N-连接糖基化所致向上迁移和拖尾，说明异源昆虫Pgp可在哺乳动物肠道模型中正确表达。2.3 工程化Caco-2细胞系屏障性质增强中，所有回补系TEER均高于野生型500 Ω·cm2，PgpKO与HaPgp达1000至1150 Ω·cm2，说明遗传改造未破坏而且增强了紧密连接屏障，适合比较渗透研究。2.4 棉铃虫Pgp同源蛋白可像人类Pgp一样高效外排Rhod123中，野生型Rhod123 ER约63，PgpKO近零，HaPgp与HsPgp回补后分别为15.4与17.9，AgPgp为11.6且维拉帕米将其从8.8降至2.8，结论是昆虫Pgp具有保守外排功能但绝对外排强度低于内源人类Pgp，可能受表达量或底物亲和力影响。2.5 农药外排活性比较分析中，地高辛在野生型ER约21，PgpKO近零，Ha/Ag/Hs回补系分别为4.2、3.4、4.0；甲基对硫磷ER从野生型4.67降至PgpKO 2.52，回补后恢复至约4.0至4.41，说明其外排具Pgp依赖性且种间选择性低；三氟咪吡喃在野生型与PgpKO间无显著差异（p=0.13），昆虫Ha Pgp未恢复显著转运，但各系基线ER约8，提示其可能由乳腺癌耐药蛋白（BCRP, breast cancer resistance protein）或其他多药耐药相关蛋白（MRPs, multidrug resistance-associated proteins）外排而非Pgp。
讨论部分总结中，研究人员指出该“昆虫化”Caco-2平台以干净敲除背景加异源表达实现难在原生组织完成的跨物种转运比较。Pgp缺失不破坏上皮屏障，甚至可能通过补偿性转运蛋白上调增强TEER。Rhod123被确立为灵敏Pgp报告探针。昆虫Pgp可识别并外排地高辛与甲基对硫磷等结构各异底物，支持其在害虫多药抗性中的作用；三氟咪吡喃低Pgp依赖性则强调化合物专属转运谱对抗性风险评估的价值。平台局限在于高亲脂、难溶化合物可能非特异性吸附或滞留单层，可借接收室加牛血清白蛋白（BSA, bovine serum albumin）维持漏槽条件来改进。
研究结论部分译为：研究人员成功建立并验证基于基因工程Caco-2细胞的体外渗透与外排筛选平台。通过移除内源性P-糖蛋白（PgpKO）并稳定表达来自人类（Homo sapiens）、棉铃虫（Helicoverpa armig
era）与疟蚊（Anopheles gambiae）的Pgp同源蛋白，可定量测量昆虫Pgp同源蛋白对工具化合物与农药的转运能力。初始表征确认PgpKO中Pgp有效敲除；功能上Pgp缺失使主动外排近完全丧失，使之成为异源表达研究的洁净背景。TEER显示PgpKO屏障更强，可能源于替代外排转运蛋白补偿。Rhod123优于RhodB作为Pgp底物。Ha Pgp外排Rhod123效率可与Hs Pgp相比，但绝对ER低于野生型，反映表达水平、膜密度或固有底物亲和力差异。地高辛证实平台敏感性；甲基对硫磷显示低选择性Pgp依赖外排；三氟咪吡喃不主要依赖Pgp，高基线ER提示其可能为BCRP或MRPs底物。该体系通过洁净敲除背景与昆虫及人类转运蛋白异源表达，提供原生组织难以实现的直功能比较，并为杀虫剂抗性中外排转运蛋白作用提供机制洞察；未来可拓展至其他转运蛋白。
