《International Journal of Molecular Sciences》：Altered Maternal Circulating and Placental microRNA-369-5p and microRNA-671-3p Expression in Intrahepatic Cholestasis of Pregnancy: Comparison of ICSI and Spontaneous Conception
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中文摘要翻译：为探讨接受卵胞浆内单精子注射（ICSI）的妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）女性与自然受孕者相比，其母体外周血白细胞、血浆及胎盘组织中microRNA-369-5p（miR-369-5p）和miR-671-3p的表达情况。在这项探索性队列研究中，研究
中文摘要翻译：为探讨接受卵胞浆内单精子注射（ICSI）的妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）女性与自然受孕者相比，其母体外周血白细胞、血浆及胎盘组织中microRNA-369-5p（miR-369-5p）和miR-671-3p的表达情况。在这项探索性队列研究中，研究人员采用实时定量PCR技术分析了四组女性的母体外周血白细胞、血浆及胎盘组织中的miR-369-5p和miR-671-3p表达水平：（1）经ICSI受孕的无并发症妊娠女性（non-ICP-ICSI，n=7）；（2）经ICSI受孕的ICP女性（ICP-ICSI，n=7）；（3）自然受孕的ICP女性（ICP-SC，n=7）；（4）自然受孕的无并发症妊娠女性（non-ICP-SC，n=7）。采用RQ法计算相对表达水平。与ICP-SC组和non-ICP-SC组相比，ICP-ICSI组和non-ICP-ICSI组的白细胞miR-369-5p表达显著上调（p=0.0001）。与自然受孕组相比，ICSI组的血浆miR-671-3p表达水平显著降低（p=0.029）。四组间胎盘组织中miR-369-5p和miR-671-3p的表达水平无显著差异（p>0.05）。亚组分析显示，ICP-ICSI组的白细胞miR-369-5p和miR-671-3p表达水平显著高于ICP-SC组（p<0.05）。血清空腹胆汁酸水平与胎盘miR-369-5p表达呈显著正相关（r=0.467；p=0.012），与血浆miR-369-5p表达呈负相关（r=-0.413；p=0.029）。研究结果表明，在这一探索性队列中，miR-369-5p和miR-671-3p在白细胞和血浆中的表达存在区室特异性差异。这些初步观察结果不能确立因果关系，需要在更大规模的独立队列中进行验证。
论文解读
妊娠期肝内胆汁淤积症（ICP）是一种妊娠期特发性可逆性肝脏疾病，以皮肤瘙痒和血清胆汁酸升高为主要特征，多发生于妊娠中晚期，其发病率在全球范围内因种族、地域和季节差异而介于<1%至27.6%之间。ICP与不良围产结局密切相关，包括宫内胎儿死亡、羊水胎粪污染、早产、产时胎儿窘迫及缺氧缺血事件。近年证据提示，经辅助生殖技术（ART）受孕的单胎及多胎妊娠中ICP的发生率高于自然受孕，可能与体外受精（IVF）妊娠中脐血雌二醇和孕酮水平升高、胚胎着床异常及妊娠微环境改变有关，并可能存在雌激素升高损害遗传易感个体胆汁酸转运的机制。MicroRNA（miRNA）是一类约22个核苷酸的内源性单链非编码RNA，在转录后水平调控基因表达。miR-369-5p基因位于染色体14 miRNA簇（C14MC）内，该簇在胎盘发育中发挥重要作用；先前研究显示miR-369-5p在分化细胞中下调，并可能调控代谢剪接因子和细胞重编程过程，还可通过靶向HOXA13抑制肝细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。有研究发现ICP患者尿液样本中hsa-miR-369-5p表达较正常妊娠显著上调。miR-671编码于染色体7q36.1，已涉及多种癌症、动脉粥样硬化、缺血性卒中、肝纤维化和骨关节炎等疾病，可能参与代谢调控；miR-671-3p已被提出可作为胎盘植入谱系障碍产前筛查的潜在非侵入性生物标志物，并在ICP患者尿液中显著上调。然而，既往尚无研究同时评估ART受孕与自然受孕ICP孕妇母体白细胞、血浆及胎盘中miR-369-5p和miR-671-3p的表达差异。为此，研究人员开展了一项前瞻性队列研究，旨在比较经卵胞浆内单精子注射（ICSI）受孕的ICP女性与自然受孕者在母体外周血白细胞、血浆和胎盘组织中这两种miRNA的表达水平。该研究于2019年7月至2022年3月在伊斯坦布尔梅德尼耶特大学附属Goztepe Prof. Dr. Suleyman Yalcin City医院产前门诊进行，共纳入28例单胎高加索孕妇，分为四组：自然受孕正常妊娠组（non-ICP-SC，n=7）、自然受孕ICP组（ICP-SC，n=7）、ICSI受孕正常妊娠组（non-ICP-ICSI，n=7）和ICSI受孕ICP组（ICP-ICSI，n=7）。ICP诊断标准包括妊娠期无皮疹的全身瘙痒、总血清胆汁酸≥10 μmol/L、天冬氨酸转氨酶（AST）和/或丙氨酸转氨酶（ALT）>40 U/L、肝胆囊超声正常以及甲型、乙型、丙型肝炎血清学检查阴性。排除标准包括子痫前期、妊娠期糖尿病、已知或疑似肝胆疾病、宫内胎儿死亡、胎儿染色体或结构异常、多胎妊娠以及使用供卵或非促性腺激素释放激素（GnRH）拮抗剂方案的ICSI周期。所有ICSI妊娠均来自冻融胚胎移植（FET）周期。研究人员收集了详尽的人口学及临床资料，包括年龄、孕产次、体质指数（BMI）、吸烟史、ICP诊断孕周、熊去氧胆酸（UDCA）治疗、产前糖皮质激素使用、血清空腹胆汁酸、肝功能指标、围产结局等。在分娩前采集外周静脉血，分离白细胞和血浆；胎盘组织于分娩后立即从距脐带插入点4–5 cm的标准部位取材并液氮冻存。使用TRIzol试剂提取白细胞和胎盘组织总RNA，血浆RNA使用Quick-cfRNA Serum/Plasma Kit提取，采用实时定量PCR（RT-qPCR）检测miR-369-5p和miR-671-3p表达，以RNU6作为组织和白细胞样本的内参，以miR-423-3p作为血浆样本的内参，采用2
?ΔΔCt法计算相对定量值（RQ）。统计分析采用SPSS 14.0，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni事后检验，相关性分析采用Pearson相关系数。研究经G*Power软件先验功效分析，基于效应量Cohen's f=0.75、α=0.05，每组7例的总样本量可提供88%的统计功效。
研究结果显示，在母体特征方面，各组的年龄、分娩时BMI和吸烟状况无显著差异；ICP-ICSI组（35.10±3.12）与ICP-SC组（34.01±1.97）的ICP诊断年龄无显著差异，血清空腹胆汁酸水平在两组间也无显著差异（p=0.125）。总胆红素、结合胆红素、碱性磷酸酶（ALP）、AST和ALT水平在ICP-ICSI和ICP-SC组中均显著高于non-ICP-SC组（p<0.05）。各组间分娩孕周、分娩方式、脐血pH、新生儿重症监护病房（NICU）入住、胎儿窘迫及羊水胎粪污染的发生率均无显著差异。在miRNA表达方面，白细胞miR-369-5p表达在ICP-ICSI组（RQ=11.46±2.34）和non-ICP-ICSI组（RQ=9.28±2.50）中显著高于ICP-SC组（RQ=2.29±2.89）和non-ICP-SC组（RQ=0.00±1.129）（p=0.0001）。血浆miR-369-5p表达在ICP-ICSI组（RQ=-1.55±2.23）和ICP-SC组（RQ=-1.39±0.89）中显著低于non-ICP-ICSI组（RQ=1.64±2.79）和non-ICP-SC组（RQ=0.00±2.44）（p=0.042）。四组间胎盘miR-369-5p表达无显著差异（p=0.150）。白细胞miR-671-3p表达在ICP-ICSI组（RQ=10.68±2.45）和non-ICP-ICSI组（RQ=7.32±2.01）中显著高于ICP-SC组（RQ=2.12±1.45）和non-ICP-SC组（RQ=0.00±0.87）（p=0.0001）。血浆miR-671-3p表达在ICP-ICSI组（RQ=-1.42±1.65）和non-ICP-ICSI组（RQ=-2.73±1.95）中显著低于ICP-SC组（RQ=-0.23±0.37）和non-ICP-SC组（RQ=0.00±2.38）（p=0.029）。四组间胎盘miR-671-3p表达无显著差异（p=0.247）。成对比较显示，ICP-ICSI组白细胞miR-369-5p和miR-671-3p表达均显著高于non-ICP-SC组（p<0.001）和ICP-SC组（p<0.001）；non-ICP-ICSI组白细胞两种miRNA表达也显著高于non-ICP-SC组（p<0.001）；non-ICP-ICSI组血浆miR-671-3p表达显著低于non-ICP-SC组（p=0.046）。相关性分析显示，胎盘miR-369-5p与血浆miR-369-5p表达呈显著负相关（r=-0.545；p=0.003），白细胞miR-671-3p与血浆miR-671-3p表达呈负相关（r=-0.401；p=0.034）。血清空腹胆汁酸水平与胎盘miR-369-5p表达呈显著正相关（r=0.467；p=0.012），与血浆miR-369-5p表达呈显著负相关（r=-0.413；p=0.029）。血清总胆红素水平与血浆miR-369-5p表达呈显著负相关（r=-0.50；p=0.007）。血清空腹胆汁酸水平与胎盘miR-671表达呈显著正相关（r=0.430；p=0.022）。出生体重与血浆miR-671表达呈显著正相关（r=0.486；p=0.009）。
讨论部分指出，miR-369-5p和miR-671-3p涉及间充质基质细胞成脂分化、糖尿病、胰岛素分泌受损、心脏纤维化和肝细胞癌等多种病理过程。miR-369作为母源印记C14MC簇的成员，与重度子痫前期、早产和小于胎龄儿（SGA）等不良妊娠结局相关，但本研究中四组SGA发生率无显著差异。先前Ma等报道ICP患者尿液miR-369-5p和miR-671-3p表达上调，支持其作为ICP潜在生物标志物的价值。本研究发现白细胞miR-369-5p在ICSI妊娠中显著上调，与ICP状态无关，提示其与ART操作本身关联更强，可能反映了辅助生殖相关的免疫或炎症激活；而血浆miR-369-5p在ICP组中降低，提示其与ICP诊断相关。白细胞miRNA表达与血浆或胎盘表达不一致，说明存在区室特异性调控。miR-671-3p在白细胞中的上调与ICSI相关，在血浆中的下调也与ICSI相关，且胎盘表达无组间差异，但胎盘miR-671表达与血清胆汁酸正相关，提示miR-671可能参与ICP发病。研究还观察到白细胞与血浆miRNA水平的负相关，可能反映个体生物学差异而非分析前因素。尽管存在这些发现，但胎盘miRNA表达无明显差异而循环区室改变显著，提示区室特异性调控机制的存在，具体机制尚无法从当前数据确定。研究局限性包括每组仅7例的小样本量、缺少功能实验、未对多次检验进行校正、所有ICSI妊娠均来自相同方案的冻融胚胎移植周期、未定量评估溶血、母血采集时间点单一等，因此结果应视为探索性，需在更大规模独立队列中验证，未来应研究不同ART方案（如新鲜IVF、ICSI和宫腔内人工授精）中的miRNA表达，并探索其转化应用价值。
结论部分总结，该研究首次比较了经ICSI受孕和自然受孕的ICP孕妇母体白细胞、血浆和胎盘中miR-369-5p和miR-671-3p的表达谱。在这一探索性队列中，观察到的白细胞和血浆表达模式与受孕方式和ICP状态相关，而胎盘表达无统计学显著差异。这些发现是初步的，不能确立ICSI的因果效应或免疫介导清除机制，需要在更大规模的独立队列中验证这些关联并探索其潜在转化相关性。
