《International Journal of Molecular Sciences》：Nerve Cell Responses to Biocompatible RGO–Chitosan–CMC Nanofiber Composite Membranes
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周围神经损伤是常见的难以克服的创伤。尽管神经移植可以快速恢复几乎所有的感觉和功能，但移植物来源仍然是一个问题。研究集中于使用手术植入支架直接重建和促进受损神经愈合的方法。神经再生可以通过旨在增强再生微环境的策略进一步促进，例如改善神经引导导管的导电性。在本研究
周围神经损伤是常见的难以克服的创伤。尽管神经移植可以快速恢复几乎所有的感觉和功能，但移植物来源仍然是一个问题。研究集中于使用手术植入支架直接重建和促进受损神经愈合的方法。神经再生可以通过旨在增强再生微环境的策略进一步促进，例如改善神经引导导管的导电性。在本研究中，研究人员制备了壳聚糖（Ch）和羧甲基纤维素（CMC）纳米纤维复合膜。为了提高膜的导电性，加入了还原氧化石墨烯（RGO）。结构分析表明Ch与CMC之间存在相互作用，并且RGO的掺入没有产生额外的可检测晶相。ChCMCRGO膜比ChCMC膜显示出略高的导电性和更大的表面亲水性，并支持更大的神经突向外生长。
周围神经损伤是临床常见且难以逆转的创伤。2021年全球疾病负担研究显示，全球约有413万例新发神经损伤病例，约44万伤残生存年（YLDs），凸显了该类损伤带来的持续性功能残疾负担。严重神经损伤需手术干预，传统“金标准”疗法为自体或异体神经移植，但存在供区创伤与感觉缺失、修复部位神经瘤形成及异体移植排斥等问题。组织工程的发展促使研究者开发可植入神经导管支架以替代移植。理想的导管材料须具备生物相容性、可降解性、渗透性和柔韧性。壳聚糖（Ch）作为源自甲壳素的天然半结晶多糖，具备上述优良性能，已被广泛用于神经导管构建；羧甲基纤维素（CMC）是源于纤维素的阴离子多糖，具有良好细胞粘附性、低细胞毒性和可降解性，但单独作为导管材料存在吸水率过高的局限。还原氧化石墨烯（RGO）可由石墨经氧化还原制得，作为导电填料可改善聚合物导电性，且保留的含氧基团赋予其一定亲水性。既往研究表明电刺激能显著加速受损神经的再生与功能恢复，因此通过掺入RGO提高导管导电性有望增强神经修复效果。本研究旨在制备Ch/CMC纳米纤维复合膜并掺入不同浓度RGO，评价其结构、理化性能及神经细胞相容性，为周围神经再生导管的设计提供实验依据，相关成果发表于《International Journal of Molecular Sciences》。
研究人员采用真空过滤法制备了Ch/CMC（7:3重量比）复合膜，并掺入0、3、6、10 wt%的RGO，对膜材料从结构、电学、力学和生物学多个维度进行了系统表征与评价。
关键技术方法包括：1) 真空过滤法制备Ch/CMC（7:3）纳米纤维复合膜并掺入0–10 wt% RGO；2) X射线衍射（XRD）和衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析晶体结构与化学结构；3) 场发射扫描电镜（FE-SEM）观察表面形貌，接触角测量评估润湿性；4) 四探针法测量电导率；5) 单轴拉伸测试力学性能；6) 培养RT4-D6P2T雪旺细胞系（ATCC CRL-2768），结合免疫荧光评估细胞形态、细胞骨架组织与增殖；7) Western blot检测相关蛋白表达；8) 分离雌性成年Wistar大鼠（Envigo Laboratories, Milan, Italy）背根神经节（DRG）神经元进行培养和免疫荧光分析。
2.1 膜性能
XRD图谱显示所有衍射峰均对应于Ch的晶面（2θ=10°、15.2°、20°、22.4°），未检测到CMC和RGO的特征峰，表明CMC以无定形态分散于半结晶Ch纳米纤维基质中，且RGO掺入未诱导新的晶相。ATR-FTIR光谱显示Ch的氨基相关谱带（1655 cm
-1）在形成ChCMC膜后移至1645 cm
-1，位移约10 cm
-1，提示Ch质子化氨基与CMC羧酸根之间形成静电相互作用；RGO掺入未产生新的化学键。水接触角随RGO含量增加从95.3°单调降至65.3°，表明RGO提高了膜表面亲水性。电导率从ChCMC的65 μS/cm略增至ChCMCRGO10的77 μS/cm，电阻从660 kΩ降至580 kΩ，但差异无统计学意义，且未观察到渗流阈值，表明在10 wt%范围内RGO未形成完整的导电渗透网络。所有膜均呈先线性弹性后应变软化的塑性材料特征；随RGO含量增加，屈服强度从63 MPa降至57.5 MPa，杨氏模量从2 GPa降至1.6 GPa，提示RGO掺入主要影响膜刚度而非强度。
2.2 RT4-D6P2T细胞形态、细胞骨架组织与增殖
RT4-D6P2T雪旺细胞在所有膜上均能粘附并随时间持续增殖，表明材料具有良好细胞相容性。高RGO含量膜上的细胞呈现更铺展的形态和更明显的肌动蛋白骨架组织。定量分析显示培养1天和3天时，膜上大多数细胞的肌动蛋白骨架呈中等组织水平，低组织化细胞比例不超过2%。板状伪足和丝状伪足的形成与玻璃对照组相当，仅ChCMCRGO6组在1天时显著减少，可能反映了细胞对材料表面的早期适应反应。膜上细胞增殖率低于玻璃对照组，但7天时差异趋于缩小。
2.3 RT4-D6P2T细胞蛋白表达
Western blot结果显示总AKT在整个培养期间均可检测到；ChCMCRGO6和ChCMCRGO10膜上的细胞在5、7天时pAKT信号较弱，但因蛋白样本为合并收集，无法进行可靠的密度定量，仅作为探索性观察。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax在各膜组成和培养时间下均持续可检测，条带强度无明显差异，与细胞活力维持的结果一致。
2.4 DRG神经突生长
β-微管蛋白III免疫荧光染色显示，DRG感觉神经元在含RGO膜上培养3天后神经突长度显著增加。ChCMCRGO6和ChCMCRGO10组的神经突长度显著超过玻璃对照组和不含RGO的ChCMC膜组，表明RGO掺入对神经元突起生长具有促进作用。
讨论总结与结论：Ch和CMC通过静电相互作用形成稳定的无相分离复合膜。RGO掺入改善了膜表面亲水性和导电性，同时降低了材料
