《Biomolecules》：Genome-Wide CRISPR Screens Identify Genome Stability as Regulator of the Cellular Sensitivity to Environmentally Relevant Bisphenol A Exposure
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双酚A（BPA, Bisphenol A）是用于塑料生产的高产量化学品。尽管其对生殖系统的不良影响已有记录，但较新研究还将BPA暴露与致癌作用及基因组不稳定性联系起来。然而，这些研究通常使用远高于一般人群血清或尿液中观察到的BPA浓度，使其相关性不明确。为此，
双酚A（BPA, Bisphenol A）是用于塑料生产的高产量化学品。尽管其对生殖系统的不良影响已有记录，但较新研究还将BPA暴露与致癌作用及基因组不稳定性联系起来。然而，这些研究通常使用远高于一般人群血清或尿液中观察到的BPA浓度，使其相关性不明确。为此，研究人员报道了一项无偏遗传学研究，用以识别对塑料制造工人相关暴露水平产生应答的机制。研究人员在HeLa和RPE1细胞中进行了全基因组CRISPR敲除（knockout, KO）筛选，连续暴露于0.5 μM BPA（该浓度类似于塑料制造业工人尿液中的平均BPA浓度），持续19天。研究人员发现基因组稳定性基因是两种细胞系间排名靠前的共同命中（hit）之一，表明在此环境相关暴露剂量下BPA可引起DNA损伤。研究人员验证了DNA修复基因RAD51C和RNA解旋酶DDX21为BPA抗性所需基因。该研究提示，环境相关剂量BPA暴露可导致DNA损伤，凸显BPA与致癌作用的相关性。
论文《Genome-Wide CRISPR Screens Identify Genome Stability as Regulator of the Cellular Sensitivity to Environmentally Relevant Bisphenol A Exposure》发表于《Biomolecules》。研究背景方面，BPA是高产量化学品，广泛用于聚碳酸酯塑料、食品罐内衬、供水管道和牙科封闭剂等。一般人群和塑料制造业工人均可检出BPA，工人尿液BPA浓度范围很高，而塑料行业缺乏职业安全与健康管理局（OSHA, Occupational Safety and Health Administration）标准保护。既往BPA致癌性研究多聚焦雌激素受体（ER, estrogen receptor）信号激活、染色体错误分离、R-loop形成及高剂量下DNA加合物形成；但多数机制研究使用远高于人群相关水平的BPA浓度，因此低剂量、职业相关暴露是否引起DNA损伤仍存争议。为回答该问题，研究人员以类似塑料制造业工人尿液浓度的0.5 μM BPA连续处理细胞，利用无偏全基因组CRISPR KO筛选识别调控细胞BPA敏感性的基因，并验证候选基因功能，结论是职业相关低剂量BPA可造成DNA损伤，基因组稳定性通路是主要防御机制。
主要技术方法上，研究人员使用Brunello人CRISPR KO池状慢病毒库，在HeLa与RPE1-p53KO两种细胞系中建立约250倍文库覆盖的库感染细胞；以0.5 μM BPA或二甲基亚砜（DMSO, dimethyl sulfoxide）连续处理19天，每3天传代并补加BPA；收集基因组DNA后扩增引导RNA（gRNA, guide RNA）区并测序，用MAGeCK算法鉴定BPA敏感性基因，用DAVID进行基因本体（GO, Gene Ontology）富集；功能验证采用Western blot、21天细胞存活计数、γH2AX与53BP1免疫荧光、膜联蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（PI, propidium iodide）流式分析；R-loop检测用S9.6抗DNA-RNA杂交体抗体与双链DNA（dsDNA, double-stranded DNA）抗体的邻近连接分析（PLA, proximity ligation assay）。
3.1. CRISPR Screens to Identify Genetic Determinants of the Cellular Response to Low-Dose BPA Exposure：研究人员在HeLa和RPE1细胞中进行全基因组CRISPR KO筛选，0.5 μM BPA处理19天。结果显示BPA轻微促进库感染细胞增殖；MAGeCK评分低于0.01的Top命中在兩系中有64个共同基因，高于随机重叠28个。GO分析显示两系特有过程重叠有限，但DNA修复、细胞周期、姐妹染色单体黏连和染色体不稳定性等DNA相关过程是共同主题，提示低剂量BPA暴露引发基因组稳定性压力。
3.2. Validation of Top Hits from the CRISPR Screens for BPA Sensitivity：研究人员用sgRNA稳定敲低CPSF2、ATG9A、RAD51C和DDX21。21天0.5 μM BPA处理显示，RPE1中sgATG9A与sgCPSF2、HeLa中sgATG9A、RPE1中sgRAD51C与sgDDX21、HeLa中sgDDX21均较对照更敏感；结论为ATG9A、CPSF2、RAD51C和DDX21是职业相关BPA抗性的必需基因。
3.3. RAD51C Suppresses BPA-Induced DSBs：RAD51C属RAD51旁系同源蛋白，参与同源重组（HR, homologous recombination）修复DNA双链断裂（DSB, double-stranded break）。0.5 μM BPA处理3天增加γH2AX灶点；RAD51C缺失本身升高γH2AX，但BPA处理反而降低γH2AX灶点。53BP1作为非同源末端连接（NHEJ, non-homologous end joining）相关DSB标记，在sgRAD51C细胞中随BPA上升。结论为低剂量BPA可致DSB，HR可修复该损伤；RAD51C缺失使HR与DSB信号受损，损伤转向易错NHEJ，可能增加染色体重排。
3.4. DDX21 May Suppress the Accumulation of BPA-Induced R-Loops in Estrogen Receptor-Negative Cells：DDX21为RNA解旋酶，可抑制R-loop。免疫荧光显示0.5 μM BPA 3天增加HeLa与RPE1中DDX21核灶；Western blot确认两系无/低ER。PLA显示BPA增加S9.6-dsDNA信号，即ER非依赖R-loop形成；sgDDX21细胞中该信号进一步增强。结论为职业相关低剂量BPA可在ER阴性细胞中诱导R-loop，DDX21对抑制此类R-loop和维持基因组稳定至关重要。
讨论部分总结：研究人员指出既往高剂量BPA研究难以代表人群暴露，本研究以0.5 μM工人相关浓度在癌细胞与非转化上皮细胞双模型中点明DNA稳态通路为共同应答。研究将RAD51C与家族性乳腺癌/卵巢癌及范可尼贫血（FA, Fanconi anemia）易感性联系起来，提示HR基因缺陷者可能对BPA更敏感。研究还提出BPA加合物、复制叉停滞、单链DNA（ssDNA, single-stranded DNA）缺口与R-loop共同促成DSB；ER阳性组织中ER转录激活可能放大R-loop。ATG9A与CPSF2分别通过膜/自噬与mRNA多聚腺苷酸化影响BPA敏感性。局限包括筛选每细胞系仅一次、敲除未做测序验证、R-loop未用互补实验验证。总体意义在于为职业暴露防护、一般人群塑料制品监管及DNA损伤耐受机制提供依据。
结论部分翻译：尽管BPA暴露与多种不良健康效应相关，其作为致癌物的角色仍不够明确。研究人员通过在细胞中使用类似塑料制造业工人尿液和血清的BPA浓度进行无偏遗传筛选，发现DNA修复是防止BPA介导细胞毒性的主要通路。此外，研究显示必需DNA修复基因RAD51C缺失会增强BPA暴露细胞敏感性；R-loop解析基因DDX21缺失同样增强BPA敏感性。这些证据推进了对BPA扰乱基因组作用的理解，可用于界定DNA损伤耐受机制，并指导受BPA暴露患者的治疗决策。
