吲哚青绿在光照下产生活性自由基的光谱学证据

《Molecules》：Spectroscopic Evidence of Free Radicals Generated by Indocyanine Green Under Light Irradiation

　　

活性氧(ROS)，尤其是参与I型光动力机制的自由基，是光动力治疗的关键介质。吲哚青绿(ICG)是一种临床批准的近红外染料，因其光物理特性及对血清白蛋白的亲和性而日益被视为光敏剂，这种亲和性可增强其稳定性、循环时间及肿瘤蓄积。研究人员旨在表征ICG光照下生成的自由基，重点关注I型光动力机制中的氧自由基。研究人员采用电子顺磁共振(EPR)光谱结合自旋捕获剂DMPO（5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物）鉴定OSL2光纤照明器提供白光照射期间形成的自由基；依据特征超精细分裂常数分析，并与DMPO-OH、DMPO-OOH及DMPO-H加合物的模拟EPR谱比较来判定物种。研究人员以两个ICG浓度下EPR信号积分强度评估自由基浓度随时间变化；含ICG alone与ICG+牛血清白蛋白(BSA)样品间EPR强度差异显示蛋白结合对自由基生成的影响；并基于哈密顿自旋模型的光谱分析支撑物种辨识。上述发现阐释了ICG的自由基通路，增进对其I型光动力活性的理解。

研究背景方面，自由基源于正常细胞代谢，活性氧(ROS)与活性氮物种(RNS)参与生理及病理过程。ROS含自由基与非自由基，超氧自由基经歧化生成过氧化氢(H₂O₂)，再经Fenton或Haber–Weiss过程产羟基自由基(•OH)。光敏剂分两型：I型借三重态电子转移产自由基如超氧与•OH，II型经能量转移产单线态氧(¹O₂)。I型对低氧实体瘤更优，因•OH氧化最强。吲哚青绿(ICG)为FDA批准近红外荧光染料，静注后快速结合血浆蛋白主要是白蛋白，半衰期约150至180秒，经肝摄取与胆汁排泄；人血清白蛋白(HSA)作为内源性纳米载体稳定ICG、延长循环、促肿瘤蓄积并减弱聚集自淬灭。现存问题是ICG作为光敏剂的I型自由基通路缺乏直接光谱证据，且浓度与蛋白结合如何调控自由基生成不清，故研究人员用EPR自旋捕获给出直接实验证据。该文发表于《Molecules》。

主要关键技术方法上，研究人员以UV-Vis吸收光谱表征ICG在10至250 μM的浓度依赖聚集，选55与160 μM代表单体与二聚体区；用OSL2宽带光源测发射谱并与ICG/ICG-BSA吸收比较以确认光谱重叠；以X波段约9.4 GHz的EPR谱仪配DMPO自旋捕获，在暗态30分钟、光照30分钟（约50 J/cm²）、照后30分钟记录谱；用EasySpin基于自旋哈密顿模型拟合g因子、超精细耦合常数a_N与a_H及线宽ΔB_pp辨识DMPO-OH、DMPO-OOH、DMPO-H；样本为水相ICG及ICG-BSA混合物，无外部患者队列。

2.1. UV-Vis Spectral Analysis（紫外-可见光谱分析）研究人员通过记录10至250 μM ICG吸收谱，发现775 nm高于700 nm在低浓度占优，100 μM以上700 nm反超，提示二聚体贡献增加；据此选55 μM（偏单体）与160 μM（偏二聚）作EPR浓度。ICG+BSA使吸收带红移（160 μM至约734与794 nm，55 μM至约741与798 nm）且单体带增强，结论为白蛋白结合稳定单体、抑聚集。

2.2. Spectral Overlap Between OSL2 Light Source Emission and ICG Absorption（OSL2光源发射与ICG吸收的光谱重叠）研究人员将OSL2发射谱与ICG/ICG-BSA吸收比较，发现650至800 nm重叠明显，二聚带处光源强、单体带处较弱；结论为宽带光下直接激发主要来自ICG吸收区，非吸收区贡献低，但不能把光化学响应归到单波长。

2.3. Identification of Radical Species by EPR Spin Trapping（EPR自旋捕获辨自由基物种）研究人员以DMPO捕集，图析DMPO-OH为四线1:2:2:1、DMPO-OOH有三组超精细常数、DMPO-H有两组的典型形；55 μM ICG照10分钟谱中蓝标•OH紫标•H。时序上无BSA时55 μM DMPO-OH照前速增、照后缓增，160 μM照中降约19%；DMPO-H趋势不规则。ICG-BSA中DMPO-OH全程渐增且无强烈光依赖，DMPO-H略降。拟合得55 μM ICG初态DMPO-OH、DMPO-H、DMPO-OOH权重约29%、25%、46%，终态DMPO-OH达55%（ICG）与62%（ICG-BSA），OOH短寿转OH。结论为浓度与蛋白显著调变自由基生成，BSA稳境抑重组。

讨论部分总结：研究人员指出高浓度聚集改激发态与重组使动力学异于低浓度；BSA造微环境使自由基演变和缓、弱光依赖；I型与已报II型单线态氧可共存，相对贡献随浓度与环境变。ICG光动力活性对聚集及生物分子互作极敏感，优化其光敏性能须顾此平衡。

结论部分翻译：UV-Vis与EPR联合结果表明ICG光动力行为强烈依赖染料浓度与分子环境。UV-Vis证实水相中浓度依赖聚集显著影响光化学反应性。EPR自旋捕获揭示DMPO-OH与DMPO-H加合物，证成与I型光动力通路一致的自由基物种；DMPO-OH为主信号，表明羟基类自由基路径在所用条件下占要。高浓度下聚集增强伴生自由基生成动力学改变，或因激发态性质改及重组增。BSA进一步调制体系，表明蛋白结合经造敏化剂微环境而影响聚集态与ROS形成。虽结果确证I型通路自由基，但光依赖适中与前报单线态氧生成指示I型与II型机制可共存，贡献比赖浓度与分子环境。该发现凸显ICG光动力活性对聚集态及生物分子互作高度敏感，显著影响自由基与单线态氧路径平衡，对理解优化ICG作为光动力治疗光敏剂具相关意义。