真菌黑色素作为潜在的活性氧清除性神经保护剂

《Molecules》：Fungal Melanins as Potential Reactive Oxygen Species-Scavenging Neuroprotective Agents

　　

氧化应激与神经退行性疾病（如帕金森病（PD））中的神经元损伤密切相关。真菌黑色素是显著的自由基清除剂；然而，其保护神经元免受活性氧（ROS）诱导损伤的能力仍未得到充分研究。本研究评估了真菌黑色素及其精氨酸修饰衍生物对SH-SY5Y细胞针对神经毒素的神经保护作用及其对ROS水平的影响。暴露于0.6 mM H₂O₂或1 mM MPP⁺显著升高ROS水平，并将细胞活力分别降低至约56%和60%。在10 μg/mL浓度下，来自Apioperdon pyriforme、Russula nigricans和Xylaria nigripes的黑色素显著保护细胞免受H₂O₂细胞毒性损伤，而来自Scleroderma sinnamariense皮部的精氨酸修饰黑色素显著减轻了MPP⁺的细胞毒性。进一步的剂量依赖性评估显示，A. pyriforme黑色素（10–12 μg/mL）显示出与阳性对照（164 μg/mL N-乙酰半胱氨酸（NAC））相当的抗H₂O₂活性，将细胞活力提高至90%。同样，来自S. sinnamariense皮部的精氨酸修饰黑色素（6–10 μg/mL）与NAC对MPP⁺显示出相当的保护作用，将细胞活力提高至80%。两种样品均将ROS水平抑制至与未处理对照相当或更低的水平。来自A. pyriforme的黑色素是进一步研究PD补充疗法的有前景候选物。

神经退行性疾病（NDs）是全球重大健康问题，其中帕金森病（PD）患病率快速增长。氧化应激（OS）是NDs发生发展的核心机制之一，活性氧（ROS）产生与内源抗氧化失衡可造成生物分子和细胞结构损伤。大脑耗氧量高而内源防御有限，因此对OS尤为敏感。黑色素具有自由基清除、金属螯合等特性，人脑中的神经黑色素（NM）在生理状态下发挥保护作用，但在病理条件下其功能受损，可能促进PD进展。因此，外源性黑色素，尤其可规模化生产的真菌黑色素，有望作为补偿性抗氧化策略。然而，真菌黑色素水溶性差，且来源于子实体的研究较少，其对神经元ROS损伤的保护作用仍未充分阐明。该研究发表于《Molecules》，旨在系统比较天然及精氨酸修饰的真菌黑色素对SH-SY5Y细胞遭受H₂O₂和MPP⁺毒性的保护作用及ROS清除能力。

研究人员从越南和比利时采集真菌子实体，Xylaria nigripes菌核购自越南胡志明市，通过形态学和ITS序列鉴定物种。采用碱溶酸沉和酸水解提取纯化黑色素，并通过精氨酸修饰提高水溶性。以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞（ATCC CRL-2266）为模型，使用MTT法测定细胞活力，DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平，通过初筛和剂量-反应实验评估保护作用。

2.1 产黑色素真菌种类：研究人员提取了来自9种真菌的10个黑色素样品，产量差异显著，其中Fomes fomentarius产量最高（99.83 mg g^?1），其次是Apioperdon pyriforme（90.16 mg g^?1），X. nigripes最低（3.46 mg g^?1）。基于产量、碱性溶解度、精氨酸修饰可行性及先前报道的抗氧化活性，选择A. pyriforme、Russula nigricans、Scleroderma sinnamariense（皮和孢子）及X. nigripes进行后续研究。

2.2 不同浓度黑色素和精氨酸修饰黑色素对SH-SY5Y细胞活力的影响：MTT结果显示，大多数样品在10 μg/mL时无明显毒性，而高浓度（80、100 μg/mL）普遍降低细胞活力；精氨酸修饰后毒性总体降低。因此选择10 μg/mL作为筛选浓度。

2.3 筛选对H₂O₂毒性的保护作用：以10 μg/mL样品预处理并共处理0.6 mM H₂O₂，A. pyriforme、R. nigricans和X. nigripes的黑色素将细胞活力从55.34%分别提高至75.31%、74.60%和73.92%，接近阳性对照N-乙酰半胱氨酸（NAC）的87.14%；形态学观察显示细胞密度和形态改善。

2.4 不同浓度有效黑色素的保护作用和ROS评估：在2–20 μg/mL范围内，三种黑色素均呈倒钟形剂量反应。其中A. pyriforme黑色素在10和12 μg/mL最具潜力，将活力从56.74%恢复至85.05%和90.32%，与未处理组和NAC组相当；相应ROS水平降至36.00%和25.13%，与对照组无显著差异。R. nigricans和X. nigripes也能降低ROS至对照水平，但细胞活力恢复不完全，提示ROS降低并不总伴随着活力恢复。

2.5 筛选对MPP⁺毒性的保护作用：以1 mM MPP⁺诱导毒性，仅来自S. sinnamariense皮部的精氨酸修饰黑色素在10 μg/mL显著提高活力从60.65%至74.92%，与NAC（76.72%）相当，形态学也显示正常形态。

2.6 不同浓度S. sinnamariense精氨酸修饰黑色素的保护作用和ROS评估：在6、8、10 μg/mL时，该样品将活力从62.62%提高至约74–80%，与NAC相当；ROS水平在8和10 μg/mL时显著低于未处理组和NAC组。此外，该样品对H₂O₂无保护作用，而A. pyriforme黑色素对MPP⁺无保护，显示明显的选择性。

讨论部分，研究人员指出黑色素类型与物种分类一致；候选