《Cancers》：The Osteosarcoma Tumor Microenvironment: From Cellular Interactions to Advanced Preclinical Models
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骨肉瘤（OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤，主要影响儿童、青少年和年轻成年人。尽管多模式治疗取得了进展，但在过去几十年中，患者的预后基本没有改变，特别是在转移性或复发性疾病的情况下。越来越多的证据强调了肿瘤微环境（TME）在OS进展、转移、免疫逃逸和治疗抵抗中的
骨肉瘤（OS）是最常见的原发性恶性骨肿瘤，主要影响儿童、青少年和年轻成年人。尽管多模式治疗取得了进展，但在过去几十年中，患者的预后基本没有改变，特别是在转移性或复发性疾病的情况下。越来越多的证据强调了肿瘤微环境（TME）在OS进展、转移、免疫逃逸和治疗抵抗中的关键作用。OS TME包含一个由肿瘤细胞、免疫细胞、癌症相关成纤维细胞、间充质基质细胞、内皮细胞、细胞外基质成分和可溶性因子组成的复杂动态网络，这些成分共同调节肿瘤行为。这篇综述总结了目前对OS TME的理解，突出了恶性细胞与其周围微环境之间的相互作用及其对肿瘤生长、血管生成、侵袭、转移扩散和治疗反应的贡献。此外，本文讨论了目前用于研究OS生物学和评估新型治疗策略的最相关临床前模型的优势和局限性。三维（3D）培养系统，包括球体、类器官和仿生支架模型，如今被认为比传统的二维培养更能重现天然肿瘤微环境的结构、机械和细胞复杂性。此外，还回顾了患者来源异种移植（PDX）模型，因其能够保留原始肿瘤的组织病理学、分子和遗传特征，使其成为转化研究、生物标志物发现和个性化医疗的有价值平台。
以下是基于论文主体部分的专业内容总结：
1. 引言
骨肉瘤（OS）是最常见且最具侵袭性的原发性恶性骨肿瘤，呈现双峰年龄分布，好发于长骨干骺端，具有高度局部侵袭和远处转移倾向，尤其易转移至肺部。约20%的患者初诊时已发生转移，五年生存率在局限性疾病患者中约为60-70%，而在转移性OS患者中低于20%。OS的一个决定性特征是高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME），它由非恶性细胞和非细胞成分组成，包括免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞、细胞外基质（ECM）及可溶性因子，共同影响肿瘤生长和药物反应。缺氧条件进一步通过促进血管生成和调节细胞因子表达来推动肿瘤发生。
2. 骨肉瘤中的肿瘤微环境
2.1. 骨细胞：成骨细胞通过调节成骨信号通路和分泌白细胞介素-6（IL-6）等细胞因子参与OS起始和转移进展，其关键转录因子RUNX家族转录因子2（RUNX2）与OS发展相关。破骨细胞介导的骨降解是OS进展的关键组成部分，RANK-RANKL信号通路的失调常发生在骨肿瘤中，激活的破骨细胞释放转化生长因子-β（TGF-β）等生长因子，促进肿瘤细胞增殖，形成骨破坏与肿瘤进展的恶性循环。
2.2. 免疫细胞：OS微环境的免疫成分以免疫抑制状态为主要特征，使肿瘤细胞能够逃避监视。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是OS TME中最丰富的免疫细胞群之一，传统上分为促炎M1表型和抗炎M2表型，但单细胞RNA测序揭示了更复杂的亚群，如M1-TAM、M2-TAM和与肺转移相关的M3-TAM。肿瘤相关中性粒细胞（TANs）可呈现抗肿瘤N1或促肿瘤N2表型，其形成的NETs与转移表型相关。髓源性抑制细胞（MDSCs）通过抑制T细胞、B细胞和自然杀伤（NK）细胞的免疫应答，并在缺氧微环境下促进血管生成和转移前生态位的形成。树突状细胞（DCs）作为关键抗原呈递细胞，存在不同亚群，其中成熟免疫调节性树突状细胞（mregDCs）可能通过与调节性T细胞（T-regs）的相互作用发挥免疫抑制活性。NK细胞具有细胞毒性活性，但OS TME中可能存在功能受损状态，而NKT样细胞显示出更强的细胞毒活化。T淋巴细胞浸润高度异质，转移灶通常表现出更高的T细胞密度和免疫检查点分子表达，反映了高度免疫抑制的微环境。
2.3. 间充质基质细胞：间充质基质细胞（MSCs）被视为OS细胞的可能前体细胞，通过释放细胞因子、趋化因子和细胞外囊泡（EVs）在肿瘤细胞与TME之间充当介质，影响血管生成、细胞增殖、侵袭、转移和化疗耐药。
2.4. 癌症相关成纤维细胞：癌症相关成纤维细胞（CAFs）在原发性和转移性OS病变中大量存在，通过多种机制促进免疫逃逸，包括分泌CXCL12限制T细胞浸润、产生TGF-β抑制T细胞活性并促进T-reg分化、招募免疫抑制细胞群体，以及重塑ECM形成物理屏障。
2.5. 内皮细胞和周细胞：内皮细胞（ECs）通过血管生成为OS提供营养和氧气，并可经历内皮-间充质转化（EndMT）促进CAFs形成。周细胞通过PDGF-B/PDGFR-β信号与ECs相互作用，调节血管稳定性和血管生成。
2.6. 细胞外囊泡：EVs是含有核酸、蛋白质和脂质的脂质包被囊泡。OS细胞分泌的外泌体可通过携带TGF-β等分子下调T细胞增殖、诱导M2极化，并干扰NK细胞和DCs的活性，从而促进免疫逃逸。
2.7. 骨肉瘤中的免疫逃逸：OS中抗肿瘤免疫反应不足的主要机制之一是T细胞功能障碍和耗竭，表现为持续表达多种抑制性受体如程序性死亡蛋白1（PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）、淋巴细胞活化基因3（LAG-3）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白3（TIM-3）。然而，单一免疫检查点抑制剂在OS中疗效有限，这归因于TME的多重特征，包括耗竭的淋巴细胞、抑制性髓系群体、不充分的免疫细胞募集、代谢限制、缺氧和基质屏障的共同作用。
3. 骨肉瘤TME的三维建模：从球体到肿瘤生物打印
3.1. 球体：三维（3D）球体是多细胞聚集体，能重现实体瘤的结构和功能特征，包括3D结构、细胞异质性和氧梯度。无支架球体通过悬滴法和超低吸附法生成，能更好地再现肿瘤细胞与ECM的相互作用。有支架球体利用生物材料衍生基质提供结构支持，模拟ECM特性，可用于研究基质硬度对肿瘤干细胞性和侵袭行为的影响。
3.2. 类器官：类器官是由患者或小鼠肿瘤来源的干细胞自我组织形成的3D多细胞结构，能重现起源组织的结构和功能特征。尽管OS类器官的应用仍缺乏标准化方案，但近期研究已证明其可行性，可用于治疗测试、生物标志物发现以及与CRISPR-Cas9筛选结合研究化疗耐药机制。
3.3. 骨肉瘤建模中的3D生物打印：3D生物打印利用天然和合成生物材料及不同细胞群体，生成高度复杂且可重复的实验性癌症模型。理想的生物墨水应模拟ECM的结构和生物学特性，羟基磷灰石（HA）常用于模拟骨组成。功能性血管化骨模型需要结合刚性聚合物、天然水凝胶和生物陶瓷填料，并通过动态灌注培养增强成骨分化和血管内皮生长因子（VEGF）表达。
4. 骨肉瘤患者来源异种移植
4.1. 骨肉瘤患者来源异种移植模型的表征：患者来源异种移植（PDX）模型通过将新鲜切除的人肿瘤组织植入免疫缺陷小鼠体内建立，保留了原始肿瘤的组织学和分子特征。需通过短串联重复序列（STR）分析和基因组测序进行验证。OS PDX在克隆保真度方面表现优异，能保持原始病灶的瘤内异质性，且表观遗传稳定性也基本得以维持。
4.2. PDX和人源化PDX的局限性：常规PDX模型因使用免疫缺陷小鼠而缺乏功能性免疫系统，无法忠实再现人免疫细胞与OS细胞的相互作用，且人类基质成分会逐渐被鼠源替代。人源化PDX模型通过移植人CD34+造血干祖细胞或过继转移人外周血单核细胞，部分克服了这一局限，可用于研究肿瘤-免疫相互作用和免疫治疗评估，但仍面临免疫重建不完全、物种差异和技术复杂性等挑战。
5. 肺转移微环境
肺是OS最关键的转移部位，构成一个动态微环境。肺泡巨噬细胞和募集的单核细胞来源巨噬细胞可通过旁分泌信号促进OS细胞存活和增殖。中性粒细胞通过释放蛋白酶、活性氧和NETs影响转移定植。肺内皮细胞调节肿瘤细胞停滞、粘附和跨内皮迁移。活化的成纤维细胞可产生ECM蛋白和重塑酶，形成允许性的转移前生态位。ECM本身作为活跃调节因子，其成分变化影响肿瘤细胞行为。这些组分作为一个相互连接的网络运作，共同促进转移进展。
6. 结论
OS是一种高度侵袭性的原发性骨恶性肿瘤，其进展不仅受恶性细胞内在遗传改变驱动，还受TME内复杂相互作用的影响。对OS生物学的深入理解凸显了传统2D体外模型的局限性，推动了多细胞球体、支架培养、类器官、3D生物打印构建体和PDX等先进实验平台的发展。未来的研究方向将依赖于这些下一代模型与高分辨率分子技术（如单细胞多组学）的整合，以加速转化研究和推进精准医学方法。
