《Journal of Xenobiotics》：Toxicological Assessment of the Marine-Derived Cyclic Dipeptide Cyclo(Pro-Tyr) Using In Vitro, Zebrafish Embryo, and BALB/c Mouse Models
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环(脯氨酸-酪氨酸)（Cyclo(Pro-Tyr)）是一种海洋来源环二肽（cyclic dipeptide），已显示出抗癌活性，但其毒理学特征仍未被充分表征。研究人员采用互补的体外细胞毒性、斑马鱼胚胎发育毒性和小鼠亚急性的口服毒性模型，评估了Cyclo(Pro
环(脯氨酸-酪氨酸)（Cyclo(Pro-Tyr)）是一种海洋来源环二肽（cyclic dipeptide），已显示出抗癌活性，但其毒理学特征仍未被充分表征。研究人员采用互补的体外细胞毒性、斑马鱼胚胎发育毒性和小鼠亚急性的口服毒性模型，评估了Cyclo(Pro-Tyr)的初步毒理效应。细胞毒性在3T3-L1、HEK293和HepG2细胞中于0–250 μM暴露24 h后评估。发育毒性在斑马鱼胚胎中以0–1000 μM暴露至受精后96 h评估。重复剂量口服毒性研究在雄性和雌性BALB/c小鼠中以100或500 mg/kg/天给药30天开展，随后进行血液学、血清生化、脏器系数和组织病理学评估。Cyclo(Pro-Tyr)引起浓度依赖性细胞活力下降，在上端测试浓度效应显著。斑马鱼胚胎中，750和1000 μM暴露伴随死亡率升高、孵化率降低、发育畸形和体长缩短。小鼠中重复口服未导致死亡、明显临床毒性、体重或肝脾肾相对重量显著变化；但在500 mg/kg可见选定血液学和血清生化参数剂量依赖性改变，以及肝肾功能轻度炎症和退行性变化。总体而言，Cyclo(Pro-Tyr)在较高暴露浓度下表现浓度依赖性细胞和发育毒性，高测试剂量重复口服后产生轻度全身改变，为进一步临床前评估提供了初步毒理学信息。
研究背景方面，海洋生物是结构多样生物活性代谢物的重要来源，尤其在抗癌药物发现领域。其中环二肽或称2,5-二酮哌嗪（diketopiperazines, DKP）因刚性环状骨架、代谢稳定性、抗酶解及多靶点作用受到关注。Cyclo(Pro-Tyr)是由海绵Callyspongia fistularis共生菌Bacillus pumilus AMK1获得的脯氨酸-酪氨酸二酮哌嗪，已有研究证明其可通过PI3K/AKT信号和细胞周期调控在肝癌与乳腺癌模型中诱导凋亡和线粒体功能障碍。然而，尽管抗癌药效证据增加，其系统毒理学评价仍不充分。为支持转化开发，研究人员认为必须开展风险导向的初步安全评价，因此设计体外、斑马鱼胚胎与哺乳动物小鼠三层毒理框架，以明确非靶细胞毒性、发育毒性和重复给药后全身耐受性、血液学、生化及肝肾组织改变。该研究发表于《Journal of Xenobiotics》，意义在于为海洋来源环二肽类抗癌先导物的临床前安全性边界、后续剂量选择和器官毒性监测提供初步依据。
关键技术方法上，研究人员使用来自NCCS的3T3-L1、HEK293与HepG2细胞系进行24 h浓度梯度MTT细胞活力与形态学观察；以实验室繁育Danio rerio斑马鱼受精后胚胎为样本，按OECD 236从0–96 hpf观察死亡、孵化、心率、畸形与体长；以20–25 g雄雌各组的BALB/c小鼠为队列，经口灌胃100与500 mg/kg Cyclo(Pro-Tyr)连续30天，终点包括体重、肝/肾重量系数、自动分析仪血液学、试剂盒血清ALT/AST/ALP/胆红素/尿素/肌酐、以及肝肾H&E组织病理。
3.1. Cytotoxicity Effect of Cyclo(Pro-Tyr)：研究人员通过MTT与相差显微镜形态评估发现，3T3-L1、HEK293和HepG2在0–250 μM下呈浓度依赖性活力抑制，250 μM时抑制约67%–77%，HepG2较敏感；形态上出现密度下降、脱落、皱缩、圆化、胞质凝聚和膜不规则，说明Cyclo(Pro-Tyr)对纤维母、肾源和肝源细胞具有剂量依赖性细胞毒效应。
3.2. Cyclo(Pro-Tyr) Causes Concentration- and Time-Dependent Developmental Toxicity in Zebrafish Embryos：斑马鱼胚胎0–1000 μM暴露显示，低浓度耐受较好，750与1000 μM在48–96 hpf增加死亡、延迟孵化、心包水肿、未成形头尾、脊柱弯曲、色素减少和体长缩短，1000 μM死亡率约36%、孵化率约70%、72 h畸形率约48%–51%，证实浓度和时间依赖的发育毒性和致畸性。
3.3. Sub-Acute Repeated-Dose Toxicity of Cyclo(Pro-Tyr) in BALB/c Mice：30天雄雌BALB/c小鼠口服100/500 mg/kg无死亡和明显临床症状，体重增长与相对肝/肾重量无显著变化，说明重复口服在该条件未影响生长与脏器质量。
3.4. Effect of Cyclo(Pro-Tyr) on Hematological Parameters：红细胞参数、血红蛋白和血小板多维持生理范围，500 mg/kg出现白细胞（white blood cell, WBC）轻度升高、中性粒细胞与单核细胞比例上升、淋巴细胞略降，提示低级别炎症样造血反应而非明显血液毒。
3.5. Effect of Cyclo(Pro-Tyr) on Serum Biochemical Parameters：血清中AST、ALT、ALP随剂量中度升高，胆红素基本不变，总蛋白/白蛋白轻度下降但仍生理内，尿素、肌酐、尿酸轻度升，提示轻度肝细胞应激和肾滤过/排泄参数改变但无严重器质性功能障碍。
3.6. Histopathological Evaluation of Liver and Kidney：肝组织见门管区/血管周轻度炎性浸润，500 mg/kg偶见肝细胞变性及孤立坏死但架构保留；肾组织偶见间质炎性细胞浸润，肾小球与小管结构完整，无肾小管坏死或广泛肾病变更，雄雌间无显著差别。
讨论部分总结，研究人员指出抗癌候选分子需平衡疗效与安全。Cyclo(Pro-Tyr)在MCF-7乳腺癌细胞IC50约84.55 μM，而正常3T3-L1和HEK293在更高浓度才明显受损，提示一定肿瘤选择性但仍需正式治疗窗研究。斑马鱼结果符合发育毒性典型浓度-时间特征，可作为细胞与哺乳动物的桥梁。小鼠30天重复给药表明100 mg/kg较安全，500 mg/kg产生可逆/轻度肝肾应激与炎症，相对器官重量和体重未受损。研究人员强调尚无充分统计效能证明性别差异，正式NOAEL（no-observed-adverse-effect level，未观察到有害作用水平）需更大剂量范围与更长周期研究。
结论部分翻译：本研究对海洋来源环二肽Cyclo(Pro-Tyr)在细胞、发育和哺乳动物模型中提供了初步多层毒理学评估。Cyclo(Pro-Tyr)表现出浓度和暴露依赖性毒性，在斑马鱼胚胎模型最高浓度最显著；而100和500 mg/kg重复口服30天在小鼠中耐受性尚可，对生长和脏器重量无显著影响且仅见轻微组织学改变。500 mg/kg观察到的轻度生化和组织病理学改变提示有限肝肾功能累及但未造成明显器官功能损害。这些结果界定了初步耐受范围，并为Cyclo(Pro-Tyr)持续临床前开发提供安全框架，尚需机制和长期研究。
