鼻内腺病毒载体疫苗接种诱导呼吸道持久的抗体和T细胞应答

《Vaccines》：Intranasal Adenoviral Vector Vaccination Induces Durable Antibody and T Cell Responses in the Respiratory Tract

　　

背景/目的：流感病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）等呼吸道病原体对全球公共卫生构成重大威胁。当前疫苗针对呼吸道感染提供的黏膜保护有限，而疫苗诱导的免疫力会随时间推移而减弱。鼻内接种已成为诱导黏膜免疫的一种有前景的方法，然而相对较低的免疫原性和有限的持久性仍是主要挑战。为此，研究人员探索了多种提高鼻内疫苗效力的策略，包括黏膜佐剂和替代疫苗平台。在本研究中，研究人员评估了腺病毒载体疫苗诱导的系统性和黏膜免疫应答的幅度与持久性。方法：对6周龄雌性C57BL/6小鼠通过鼻内或肌内途径单次免疫腺病毒载体疫苗，并与接受一次或两次鼻内CpG佐剂蛋白疫苗的小鼠进行比较。评估血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中的体液免疫应答，以及纵隔淋巴结（mLNs）、肺脏和血液中的细胞免疫应答。研究人员进一步通过I类主要组织相容性复合体（MHC）肽四聚体染色结合血管内标记，对具有肺常驻表型的Ova特异性CD8 T细胞进行了离体直接鉴定。结果：单次鼻内腺病毒载体疫苗接种可诱导强效的血清IgG和BALF IgA应答，以及血液、mLNs和肺脏中抗原特异性CD8 T细胞应答。值得注意的是，这些系统性和呼吸道黏膜免疫应答在疫苗接种后可持续长达4个月，且在该时间点仍可检测到肺常驻CD8 T细胞应答。相比之下，肌内腺病毒载体疫苗主要诱导系统性免疫。鼻内CpG佐剂蛋白疫苗在单次接种后诱导的应答较弱，而加强接种可增强系统性抗体和细胞应答，但对黏膜免疫的诱导作用有限。结论：单次鼻内接种Ad5-Ova所诱导的系统性和呼吸道黏膜免疫应答与两次Ova+CpG接种后观察到的应答相当，并可维持长达4个月。这些发现提示腺病毒载体是诱导持久呼吸道黏膜免疫的有前景的平台。

论文解读：呼吸道病原体（如流感病毒和SARS-CoV-2）对全球公共卫生构成重大威胁。现有疫苗大多经肌内注射，主要诱导系统性免疫，对呼吸道黏膜的保护有限，且疫苗诱导的免疫力会随时间衰减。鼻内接种可在病毒入侵部位诱导黏膜免疫，如分泌型IgA（sIgA）和肺常驻记忆淋巴细胞，但鼻内疫苗的免疫原性相对较弱、应答不持久。因此，需要开发能同时增强黏膜免疫幅度和持久性的策略，包括黏膜佐剂和替代疫苗平台。腺病毒载体疫苗已在SARS-CoV-2肌内接种中广泛应用，但单次鼻内腺病毒载体疫苗能否诱导持久且协调的系统性和呼吸道黏膜免疫，仍缺少直接表征。研究人员以卵清蛋白（Ova）为模型抗原，比较了单次鼻内5型腺病毒载体（Ad5-Ova）、单次肌内Ad5-Ova、单次或两次鼻内CpG佐剂Ova蛋白疫苗的免疫应答，并随访4个月。论文发表在《Vaccines》。

主要技术与方法：研究人员使用6周龄雌性野生型C57BL/6小鼠（购自Orientbio），经鼻内或肌内接种E1/E3缺失、巨细胞病毒（CMV）启动子驱动Ova表达的Ad5-Ova载体（7×10⁸ IFU/只），或鼻内接种Ova（10 μg）加CpG寡脱氧核苷酸2395（10 μg）。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清和BALF中Ova特异性IgG、IgG1、IgG2b和IgA；采用I类MHC-肽四聚体染色联合血管内抗CD90.2标记直接离体鉴定肺常驻CD8 T细胞；以Ova_257–264（SIINFEKL）和Ova_323–339肽段刺激后经胞内细胞因子染色检测干扰素-γ（IFN-γ）产生；用流式细胞术分析mLNs、肺脏和血液中的滤泡辅助性T（Tfh）细胞、生发中心B（GC B）细胞和CD8 T细胞应答；统计采用混合效应模型、单因素方差分析或Kruskal–Wallis检验。

3.1 短期免疫原性：血清ELISA显示，单次Ad5-Ova肌内接种后1周即出现Ova特异性IgG；Ad5-Ova鼻内（IN）和肌内（IM）组均诱导出最高水平IgG，单次Ova+CpG IN组IgG较弱，第二次接种后升至与Ad5-Ova相当。4周时，BALF中仅Ad5-Ova IN组诱导出强效Ova特异性IgA，其他组极低或不可检测。细胞免疫方面，Ad5-Ova IN在2周时显著增强mLNs中CD4和CD8 T细胞活化、Ova特异性CD8 T细胞、Tfh细胞和GC B细胞应答，并在肺脏诱导更明显的活化T细胞和Ova特异性CD8 T细胞；血管内染色显示其可有效建立肺常驻CD8 T细胞。4周时，Ova+CpG IN（二次）、Ad5-Ova IN和Ad5-Ova IM组在mLNs和肺脏均检出高水平的Ova特异性CD8 T细胞，IFN-γ分泌CD8 T细胞趋势一致。

3.2 长期免疫维持：纵向监测4个月显示，Ad5-Ova IN组血清总IgG维持在稳定水平，Ova+CpG IN（二次）组在最后一个月逐渐下降；Ad5-Ova IN组IgG1下降较慢，IgG2b在Ova+CpG IN（二次）组也持续存在。4个月时，Ad5-Ova IN组BALF IgA水平最高，Ad5-Ova IN和IM组BALF IgG高于Ova+CpG IN（二次）组。血液中Ad5-Ova IM组Ova特异性CD8 T细胞水平最高；在鼻内接种组中，Ad5-Ova IN诱导出快速且持续的应答。Ad5-Ova IN组mLNs和肺脏中的Ova特异性CD8 T细胞和IFN-γ分泌细胞在4个月时显著高于Ova+CpG IN（二次）组。肺常驻记忆CD8 T细胞（CD44⁺ Ova⁺ CD90.2^? CD69⁺）在Ad5-Ova IN组较其他组高约100倍，但差异未达统计学显著。

讨论与结论：讨论部分指出，Ad5-Ova鼻内接种的强效和持久应答可能源于腺病毒载体在宿主细胞内持续合成抗原，并通过cGAS-STING等通路激活更广泛的先天免疫，促进CD8 T细胞致敏；而CpG佐剂蛋白主要经TLR9信号且抗原快速清除，需加强接种才能达到相当水平的短期免疫。该研究存在局限性，包括使用Ova模型抗原、未直接评价保护效力、机制尚未验证。未来应在流感血凝素或SARS-CoV-2刺突蛋白等临床相关抗原中验证，结合攻毒模型评估保护效果，并考虑人群体内预存抗Ad5免疫的影响。结论部分表明，单次鼻内Ad5-Ova在小鼠中诱导了强效且持久的系统性和呼吸道黏膜免疫应答，包括维持长达4个月的抗原特异性抗体和T细胞应答，以及Ova特异性肺常驻记忆CD8 T细胞；相比之下，CpG佐剂蛋白疫苗单次接种后应答较弱，需要加强接种才能达到相当的短期免疫原性。这些结果提示，腺病毒载体疫苗是单剂量黏膜免疫的一种有前景的策略。