《Cell Reports》：Atomistic TCR-pMHC interactions bias CD8 memory fate within a single antigen-specific repertoire
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记忆CD8 T细胞（CD8+ T细胞）可提供针对复发性感染和癌症的持久保护，但个体T细胞受体（TCR）克隆型如何促成不同的记忆命运仍不清楚。研究人员通过整合单细胞转录组学、配对TCR测序、力依赖性生物物理学、结构分析和体内逆转录病毒（retrogenic）验证
记忆CD8 T细胞（CD8+ T细胞）可提供针对复发性感染和癌症的持久保护，但个体T细胞受体（TCR）克隆型如何促成不同的记忆命运仍不清楚。研究人员通过整合单细胞转录组学、配对TCR测序、力依赖性生物物理学、结构分析和体内逆转录病毒（retrogenic）验证，分析了242个针对流感NP366-374/H-2Db配体（肽-主要组织相容性复合体，pMHC）的小鼠CD8 TCRαβ克隆型。在这一共享的抗原和炎症环境中，克隆型身份与中央记忆（central memory）、效应记忆（effector memory）或双极（bipolar）转录结果相关。代表性TCR的结构和生物物理分析揭示了Vα中心型（Vα-centric）与Vβ中心型（Vβ-centric）pMHC结合方式以及原子级接触的差异，这些差异与通过TCR传递的力的改变一致。这些相互作用模式与CD3ζ磷酸化、记忆转录程序、克隆扩增和异亚型交叉反应性相关。因此，TCR克隆型似乎不仅编码抗原特异性，还编码不同的记忆分化倾向，支持TCR-pMHC机械化学（mechanochemistry）有助于CD8记忆命运的模型。
本文发表于《Cell Reports》。该研究针对CD8阳性T细胞免疫记忆的形成机制，聚焦于T细胞受体（TCR）与肽-主要组织相容性复合体（pMHC）相互作用如何在同一抗原特异性库内偏置记忆细胞命运。已知免疫记忆依赖于CD8 T细胞通过克隆型TCR识别pMHC，记忆分化受抗原丰度、炎症、共刺激等外源信号及内在转录程序影响，但TCR克隆型本身是否决定记忆命运仍不明确。为回答这一问题，研究人员对流感病毒核蛋白表位NP366-374/H-2Db特异性的242个小鼠TCRαβ克隆型进行了整合分析，结合单细胞转录组学、配对TCR测序、力依赖性单分子生物物理学、X射线晶体学、分子动力学模拟及体内逆转录病毒验证，发现克隆型身份与中央记忆（TCM）、效应记忆（TEM）或双极（TBP）转录结果相关，并提出了TCR-pMHC机械化学有助于CD8记忆命运的模型。
研究采用的主要技术方法包括：使用10只B6小鼠在感染甲型流感PR8后34天，分离纵隔淋巴结中的NP366-374/H-2Db四聚体阳性CD8 T细胞，进行单细胞RNA测序（scRNA-Seq）与配对TCR测序；另取4只B6小鼠dpi33的非四聚体分选CD8记忆细胞验证基因特征，以及2只B6小鼠回忆反应样本用于分离部分克隆型。力测量采用单分子光镊测定TCR-pMHC键寿命与成栓概率；表面等离子共振（SPR）测定平衡亲和力；通过X射线晶体学解析6个TCR-pMHC复合物结构；利用CHARMM和OpenMM进行分子动力学模拟；用逆转录病毒转导造血干细胞生成retrogenic（Rg）小鼠，并过继转移至B6宿主后用PR8感染；结合流式细胞术、bulk RNA测序和Western blot检测CD3ζ Tyr142磷酸化。
研究结果如下：
1. TCR clonotypes of varying T-cell burst sizes and polarities
scRNA-Seq与配对TCR测序将NP特异性记忆CD8 T细胞分为三个TCM亚群和三个TEM亚群。分析显示，多数克隆型在两个区域中呈非随机分布，部分克隆型显著偏向TCM或TEM，另一些呈双极分布。RNA速率分析表明TCM和TEM克隆型表现出更终末分化的状态，而TBP克隆型细胞间存在双向转化流动。
2. The TCM repertoire is the most variegated
对全部克隆型的V/J基因使用和克隆大小分析显示，TCM克隆型在V/J基因使用上更多样，且更多见于低细胞数群体（单细胞或2–10个细胞）；TBP克隆型则表现为更受限的V/J组合和更大的克隆规模。基于TCR距离树将克隆型分为“短分支”和“长分支”，短分支富集TEM相关基因表达，长分支富集TCM相关基因，且独立PA224-233/Db和PB1703-711/Kb特异性库中也观察到此规律。
3. Weak TCR-NP366-374/Db bonding profiles
单分子力测量显示，多数TCM克隆型（如NP203、NP204、NP205和NP105）为弱结合且多为滑移键；TEM克隆型NP201和NP202虽也是弱结合，但在约15 pN处出现catch键峰；TBP克隆型NP101、NP207表现出滑移和catch混合特征。成栓概率在不同克隆型间差异较大，且不能单独解释转录状态。CD8共受体依赖并非所有TCM的普遍特性。
4. Retrogenic profiling reprises polarization
将表达NP101（TBP）和NP105（TCM）的Rg T细胞混合过继转移并感染PR8，30天后小鼠淋巴结中NP105 Rg T细胞表达更多的CD62L和Tcf-1，重现了scRNA-Seq中的差异。另一实验中，二次攻毒后TCM型NP204扩增显著强于TEM型NP202，证实克隆型偏置在体内可再现。
5. Crossreactivity of memory TCR clonotypes to IAV variants
对16个TCR进行9种自然流感变异肽的刺激测试，结果显示TBP克隆型（NP101、NP206、NP207）识别5种以上变异肽的比例最高（3/5），而TEM克隆型为0/5，TCM为1/6。TBP克隆型表现出最广谱的异亚型交叉反应性。
6. Structural determination of representative TCR-pMHC complexes
解析了6个TCR-NP366-374/Db复合物晶体结构。NP202、NP101、NP207、NP203具有相似的总体对接模式，而NP105和NP204形成第二类结构，其TCRα/TCRβ埋藏表面积（BSA）比值明显降低，表现为更强的Vβ主导结合。
7. Atomistic basis of CD8 memory fates
精细结构比较显示，NP101与NP202之间单个CDR3β残基差异导致Vα位置移动、疏水口袋缩小并形成盐桥；NP207与NP203在p3N、MHC H155、p7E及N58α糖基化位点上的局部接触差异改变了界面热力学和可能的负荷分配。分子动力学模拟显示不同TCR在受力时内部“hub残基”数量分布不同，支持负荷传递存在差异。
8. V-centric TCR binding is associated with differential tyrosine phosphorylation
在表达不同TCR的BW5147细胞中，经NP366-374/Db四聚体刺激1分钟后，Vα中心型的TEM TCR（NP202）的CD3ζ Tyr142磷酸化水平显著高于Vβ中心型的TCM TCR（NP105、NP204），且总酪氨酸磷酸化谱也存在差异，表明不同对接几何与近端信号相关。
9. Structural basis of heterosubtypic crossreactivity
结构分析解释了NP105能够识别E7D变异肽而NP204不能——NP105的CDR3β与p7E形成更短的氢键，而NP204的氢键更长且易被侧链缩短破坏。NP101和NP207相对NP202的对接倾斜使p6疏水口袋变小，允许更短的氨基酸侧链（异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸）插入，从而扩大变异识别谱。
10. Clonotypes shape retrogenic T-cell transcriptomes
bulk RNA测序显示Rg T细胞按克隆型形成不同转录簇：NP101富集激活相关的抑制性特征，NP105和NP204则表现活化TCM特征，表达较高Sell、Il7r、Bcl2、Gzma/Gzmb等。体外刺激实验还表明，NP204诱导Nkg7表达，而NP202和NP207更强地诱导糖酵解相关转录本，提示不同克隆型在早期抗原暴露后即出现代谢和功能分化。
讨论部分指出，克隆型特异性TCR-pMHC相互作用通过两层机制偏置记忆命运：第一层是Vα中心型与Vβ中心型的整体对接差异；第二层是近似对接模式中的原子级接触差异。由于αβTCR全受体具有结构不对称性，不同V域受力可能差异性激活CD3信号通路。作者将Vβ中心型与preTCR的p Tα-β异二聚体类比，推测其可能偏向TCM的干性维持特征，并提出“跷跷板”模型来描述力负荷在TCRα和TCRβ之间的平衡或偏置。研究结论为：TCR克隆型不仅编码抗原特异性，也编码不同的记忆分化倾向，TCR-pMHC机械化学在CD8记忆命运决定中发挥作用。该框架为TCR工程和免疫治疗设计提供了整合特异性、持久性与效应功能的新视角。
