基于结构的可溶性融合稳化的单纯疱疹病毒2型糖蛋白B抗原设计

《Cell Reports》：Structure-based design of soluble prefusion-stabilized herpes simplex virus type 2 glycoprotein B antigens

　　亮点
• 预融合稳定型HSV-2 gB外域的工程设计
• 中和抗体结合的预融合HSV-2 gB结构
• 小鼠中预融合和融合后gB免疫的广泛分析

摘要
2型单纯疱疹病毒（HSV-2）感染会导致终生反复发作的生殖器疱疹，但至今尚未有疫苗获得批准。糖蛋白B（gB）是一种III类融合蛋白，它通过从亚稳态的预融合构象转变为稳定的融合后构象来实现HSV-2的侵入。本文利用基于结构的设计方法，使HSV-2 gB保持在预融合构象。2.8 ?分辨率的冷冻电镜结构显示，预融合gB处于封闭状态，这与最近发表的开放状态不同。用预融合和融合后gB变体的蛋白质亚单位疫苗及mRNA疫苗对小鼠进行接种后，可引发强烈的体液和细胞免疫反应。尽管预融合稳定化并未提高中和抗体的滴度，但预融合gB诱导的抗体具有更高的FcγR介导的效应活性。总体而言，这些发现揭示了预融合gB的构象动态，提供了用于研究gB导向免疫反应的稳定试剂，并为HSV-2疫苗的设计提供了指导。

图形摘要

引言
2型单纯疱疹病毒（HSV-2），也称为人类α疱疹病毒2型，是最常见的性传播病原体之一，全球约有13%的成年人感染了该病毒。HSV-2主要感染黏膜上皮细胞，随后在感觉神经元中建立终生潜伏状态。HSV-2感染的特点是潜伏期和溶胀期交替出现，可能导致反复发作的生殖器病变。病毒再激活后，会从感觉神经节迁移到初次感染部位（通常位于生殖器区域）的皮肤细胞中进行再次感染。虽然许多感染是无症状的，但HSV-2可引起疼痛性水泡，并与HIV-1感染的风险增加有关。HSV-2还可通过分娩途径垂直传播，导致新生儿疱疹，严重时可能发展为威胁生命的播散性疾病。此外，慢性感染会给患者带来巨大的心理社会负担，包括污名化和情绪困扰；新兴研究还表明HSV-2可能与阿尔茨海默病等神经退行性疾病有关。虽然可以用阿昔洛韦等抗病毒药物控制复发，但目前尚无获批准的疫苗用于治疗或预防HSV-2感染。

HSV-2的感染需要囊膜糖蛋白的协同作用。糖蛋白D（gD）通过与三种受体之一结合来促进病毒侵入：疱疹病毒侵入介导蛋白（HVEM）、nectin-1或nectin-2，或3-O-硫酸化肝素。gH/gL异二聚体被认为通过将信号从受体结合传递给糖蛋白B（gB）来调节融合过程，而gB是一种对病毒侵入至关重要的保守III类融合蛋白。激活后，gB从初始的亚稳态预融合构象转变为高度稳定的融合后构象，这一过程驱动病毒膜与细胞膜的融合。

以往的HSV蛋白质亚单位疫苗研究多针对gD或组合糖蛋白抗原。由于gB容易聚集且构象不稳定，加上对其中和病毒机制的理解还不够透彻，这些研究未能充分利用gB作为抗原。当gB通过重组方式生产时，它主要呈现热力学稳定的融合后构象，这引发了关于天然预融合状态中的中和敏感性表位是否发生改变或丧失的疑问。因此，将gB稳定在预融合构象可能有助于从定量和定性两个方面提高抗体的功能反应。

基于结构的病毒融合蛋白预融合构象稳定化技术在针对I类融合蛋白的疫苗开发中具有革命性意义，例如已开发的呼吸道合胞病毒（RSV）疫苗。这种稳定化技术能够保留中和敏感性表位并增强中和抗体反应。然而，将这一策略应用于III类融合蛋白（如来自人类巨细胞病毒（HCMV）、EB病毒（EBV）或HSV-1的预融合gB）时，尚未观察到比融合后构象更优的中和滴度。尽管目前的免疫原性实验仅评估了蛋白质亚单位疫苗，尚未考虑mRNA、类病毒颗粒或复制缺陷病毒等其他递送方式。

在本文中，我们描述了一种基于结构的设计策略，用于生成可溶性的预融合HSV-2 gB外域免疫原。基于HCMV gB稳定化的原理，我们将基于结构的设计与生化和生物物理表征结合起来，评估预融合稳定性和抗原性，并评估预融合和融合后HSV-2 gB的蛋白质亚单位及mRNA疫苗的免疫原性。这项工作为III类融合蛋白的基于结构的疫苗设计提供了新思路，可能为有效HSV-2疫苗的研发铺平道路。

结果
**单点取代HSV-2 gB变体的设计与表征**
我们设计了一种可溶性基础构建体（gB-B0），包含HSV-2 gB外域（HG52菌株，残基1–731），其后是C端T4纤维蛋白三聚化基序、八个组氨酸标签和Twin-Strep亲和标签。为提高表达活性，还去除了信号序列（SS）后的富脯氨酸区域（Δ26–Δ73）（图1A）。我们使用该构建体gB-B1作为评估所有取代的基础。为了确认基础构建体的结构一致性，我们对gB-B1与小鼠抗体2c、HSV010-13和BMPC-23的抗原结合片段（Fabs）复合物进行了负染色电镜观察（ns-EM）。结果表明，gB-B1采用融合后构象，与之前确定的HSV-1 gB和HSV-2 gB的晶体及冷冻电镜结构非常相似（图S1）。

**图1 HSV-2 gB稳定化的单点取代**
(A) WT HSV-2菌株HG52 gB及其外域基础构建体（gB-B1）的示意图。N-连接糖基化位点以分支线表示。N端信号序列（SS）和C端结构域（C-term）用白色框标示。预期在预融合到融合后构象转变过程中移动的第一和第二区域分别用蓝色和粉色标示，未发生显著构象变化的区域用黄色标示。膜近端区域（MPR）和跨膜区域（TM）用灰色标示。成熟的gB-B1构建体由残基74–731组成，其后是折叠结构（Fd）三聚化域和C端标签。
(B) 三聚体预融合HSV-2 gB的同源模型侧视图。一个亚基如(A)所示为带状结构；另一个亚基用灰色表示为α-碳骨架的轮廓；第三个亚基用透明白色表示。单点取代用黄色表示硫原子、蓝色表示氮原子、红色表示氧原子。病毒膜的大致位置用虚线蓝色表示。插图显示了单点取代的原子结构。预期的二硫键用黄色虚线表示。

为了将可溶性HSV-2 gB外域稳定在预融合构象，我们借鉴了最近稳定HCMV gB的有效策略。首先使用SWISS-MODEL构建了预融合HSV-2 gB的同源模型，并以全长、去污剂可溶化的HCMV gB预融合结构（PDB: 7KDP）作为模板进行重建和优化（图1B）。基于此，设计了六个包含增强表达和稳定预融合构象的取代变体。此外还基于相同的基于结构的设计策略设计了五个HSV-2 gB变体。总共选择了11种设计：3个脯氨酸取代、1个空腔填充取代、6个工程化二硫键（5个亚基间和1个亚基内）以及1个降低疏水性的取代（W169A），用于表达和纯化（图S2）。从40 mL FreeStyle 293-F细胞培养物中纯化了分泌的gB外域变体以评估表达和二硫键形成情况。HSV-2 gB-B1的表达量为13.4 mg/L，而其他变体的表达量介于0.7至22.5 mg/L之间（图2A）。在测试的11个变体中，仅W169A的表达量显著高于gB-B1（约1.7倍）。在全长、膜结合的gB中，Trp169位于相邻亚基的膜近端区域（MPR）螺旋之间；而在我们的外域构建体中，该区域缺失，导致暴露的Trp169在表达过程中与非特异性地与膜和蛋白质结合，从而降低了分泌外域的产量。SDS-PAGE分析显示纯化变体的主要条带约为110 kDa（图2B），与糖基化单体HSV-2 gB Δ26–Δ73外域的分子量一致。在非还原SDS-PAGE下，三个亚基间二硫键变体（T238C/E676C、A150C/I672C和D698C/Q703C）的条带位于约460 kDa处（图2B，黑色箭头），表明存在二硫键连接的gB分子。尽管这些条带的分子量大于预期的三聚体（约330 kDa），但我们在HCMV和EBV的二硫键连接三聚体中也观察到了类似现象。相比之下，其他变体主要以单体形式出现（图2B，白色三角形）。

**组合变体的生化和结构表征**
我们设计了六个HSV-2 gB组合变体（gB-S1–S6；图S2；表1），每个变体包含两到四个有益的氨基酸取代，并评估它们对表达和稳定性的叠加效应。首先选择了两种亚基间二硫键T238C/E676C和A150C/A672C——它们在序列上与稳定HCMV gB预融合构象的二硫键V134C/I653C和H222C/E657C类似，并且在HSV-2 gB中也部分形成了稳定的预融合构象（图2B）。这些二硫键的设计目的是防止I区和V区（DI和DV）在构象转变过程中分离。此外还加入两个位于DV区的铰链稳定脯氨酸取代S665P和T666P，这些脯氨酸在结构转换过程中需伸展以填充DIII区的中央螺旋间隙。尽管这些脯氨酸未显著提升gB表达，但T666P的DSF谱型较好，我们推测稳定DV区的铰链可能在与成功形成的二硫键共同作用时具有叠加的稳定效果。在评估的六个组合变体中，除了gB-S6（T238C/E676C、S665P和T666P）外，其余变体的表达量均低于gB-B1及其各自的单独取代形式（图3A）。值得注意的是，gB-S6的表达水平与gB-B1相似，表明这些取代的组合恢复了单独取代形式导致的表达降低。非还原SDS-PAGE分析显示gB-S6的三元体比例显著增加（图3B，黑色箭头）。DSF分析表明，大多数组合变体的熔解温度低于gB-B1（图3C），这与预融合稳定构象的特性相符。

**结论**
总体而言，尽管某些组合变体在某些生化指标（产量、三聚体比例和热稳定性）上表现出改善，但在所有指标上并未显著优于gB-B1。此外，某些二硫键（T238C/E676C、A150C/I672C、V719C/I720C和D698C/Q703C）和脯氨酸（V664P、S665P和T666P）变体在至少一个或多个所需特性上有所改进（图2）。兩份gB-S2-2c-D48複合物的模型以絲带图形式展示，并适配到部分透明的映射体积中。黑色框标记了靠近gB融合環的二聚體界面。(F) gB-S2-Fab複合物的3.8 ?分辨率重建图，使用与(E)中相同的彩色映射密度显示。插图展示了适配到部分透明映射体积中的gB-S2中二硫鍵替代位置的放大视图。硫原子被标记为黄色。另见图S2。

组合變體
替代1
替代2
替代3
替代4

gB-S1T238C/E676CA150C/I672C
gB-S2T238C/E676CA150C/I672CS665PT666P
gB-S3T238C/E676CA150C/I672GCGS665PT666P
gB-S4T238C/E676CA150C/N671Q/I672GCGS665PT666P
gB-S5T238C/E676CS665P
gB-S6T238C/E676CS665PT666P
gB-G1T238C/E676CS665PT666P
gB-G2T238C/E676CS665PT666P
gB-G3T238C/E676CS665PT666P
gB-G2T238C/E676CS665PA256N/F257L/H258T
gB-G3T238C/E676CS665PT666PH172N/Y174T

表1 HSV-2 gB組合變體
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接下来，我们对一部分gB組合變體进行了冷冻電子顯微（cryo-EM）研究，以评估它们的構象。为了帮助表征，我们使用了两种中等亲和力的中和抗体2c和D48，这两种抗体分别 bind DI 和 DII。收集到的gB-S2显微照片——一种包含两个脯氨酸替代和两个与HCMV gB-C7中相同的二硫鍵替代的組合變體——其質量足以获得2D類平均圖和初步的中等分辨率（約11 ?）3D重建圖（表1；圖3D和3E）。我们发现在融合前構象中gB-S2是穩定的，但形成了非天然的二聚體-三聚體，其中DI界面部分由融合環中的疏水殘基介導（圖3E）。通过C3對稱性進一步處理和优化后，获得了單個融合前三聚體的3.8 ?分辨率重建圖，从而可以分析穩定替代位點（圖3F）。尽管T238C/E676C二硫鍵的映射特征清晰且連通，但A150C/I672C二硫鍵的映射是不連通的，这些殘基的Cβ原子相隔約5 ?，表明这个二硫鍵可能未能成功形成或因電子束損傷而断裂（圖3F）。这些结果表明，T238C/E676C與S665P和T666P（gB-S6中存在的替代位點）的組合可能足以穩定HSV-2的gB在融合前的構象。这一观察结果，加上gB-S6的有利表達和熱轉變特徵，促使我们選擇該變體進行进一步研究。

为了减少gB三聚體的非天然二聚化，我们进一步修改了gB-S6構造，在DI位置引入了N-連接的糖基化位點，针对gB-S2重建圖中观察到的二聚化界面（圖3E）。这种策略之前在最小化融合後HCMV gB的寡聚化方面是有效的。我们通过在211、257（靠近融合環II）和172（靠近融合環I）殘基處引入N-連接的糖基化基序，生成了三種糖基化變體——gB-G1、gB-G2和gB-G3（表1）。从40 mL的FreeStyle 293-F細胞培养物中纯化後，gB-G1和gB-G3的表達量相对于gB-S6有所增加，而gB-G2的表達量显著降低（圖3A）。非還原性SDS-PAGE分析显示gB-G1的三聚體比例减少，而gB-G2和gB-G3仍保持高水平的三聚體形成（圖3B，黑色箭頭）。糖基化對熱穩定性影响甚微，因為gB-G1、gB-G2和gB-G3的Tm值均与gB-S6相似，约为64°C（圖3C）。在所有變體中，gB-G3表现最佳，其表達量比gB-B1高3倍（圖3A），在非還原性SDS-PAGE上的三聚體含量最高（圖3B），Tm值为64°C（圖3C），这支持了其被選擇進行进一步結構分析的決策。

HSV-2 gB-G3在融合前構象中是穩定的。

我们确定了HSV-2 gB-G3与Fabs 2c和D48複合体的冷冻電子顯微結構，具備2.8 ?的全局分辨率和C3對稱性精修（圖4A；表S1）。最終模型涵盖了90–721號殘基，但由于頂端和融合環的映射特徵不佳，未能明確建立模型的168–179、247–260和461–498號殘基被省略。穩定的HSV-2 gB-G3結構包含一個N端螺旋（殘基92–100），它與DII緊密接觸（圖4B），这一特征在最近的一种HSV-1融合前穩定的gB構造中观察到，但在另一種中未观察到。我们还能够對HSV-2 gB膜遠端頂端的殘基進行建模，这些殘基形成了伸展的α螺旋，这与我们之前确定的处于融合前類構象的HCMV gB結構一致。重要的是，高分辨率映射確認了所有替代位点和蛋白間二硫鍵形成位置的側鏈，如T238C/E676C二硫鍵的連續映射所示（圖4B；圖S3），以及位點665和666引入的脯氨酸均採用了順式構象。

圖4 gB-G3與2c和D48 Fabs結合的冷冻電子顯微結構
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(A) HSV-2 gB-G3與2c和D48 Fabs複合體的電子顯微圖的側视图（左）和頂视图（右）。2c重鏈（HC）为黄色，2c輕鏈（LC）为淡黃色，D48 HC为绿色，D48 LC为淡綠色，gB-G3为三種粉色。
(B) gB-G3複合體模型的側视图（左）。模型的一个單體按结构域着色：DI：藍色，DII：綠色，DIII：黄色，DIV：橙色，DV：紅色，並以絲带图形式展示。第二个單體用灰色表示α碳骨架的卡通管線，第三个單體以透明表面形式展示，并按结构域着色。第一個插图（中间）展示了N端螺旋的放大视图。第二個插图（右）展示了gB-G3中穩定替代位的放大视图。在两个插图中，關鍵殘基以棒狀表示，鹽橋和氫鍵以綠色虛線表示，二硫鍵以黃色表示。
(C) 几種融合前穩定的 herpesvirus gB 三聚體的表面渲染圖的側视图（頂行）和自上而下的视图（底行），每個標簽下方列出了PDB代號。顶部視图中的中央螺旋以圓柱形表示，爲了清晰起見省略了分子表面。

另見圖S3和S4；表S1。

HSV-2 gB-G3的整體結構與最近報道的融合前穩定的HSV gB結構，以及HCMV和EBV的融合前gB結構非常相似（圖4C）。在融合前gB結構中，主要区别在于中央螺旋的位置以及膜遠端三聚體頂端采用開放或閉合構象的程度。HSV-2 gB-G3的中央螺旋在頂端聚合，形成了一種閉合構象，这与交聯的、全長野生型（WT）HCMV gB結構和最近確定的融合前穩定的EBV gB外域結構非常相似。相比之下，融合前穩定的HSV-1 gB結構在頂端显示了分散的中央螺旋，形成開放構象。這種開放構象也在使用融合前特異性纳米體免疫的完整長度WT HSV-2 gB複合物中观察到。有趣的是，在一項描述几种herpesvirus gB外域穩定的預印本中，融合前穩定的HSV-1 gB構造在同一數據集中 adopt 了開放和閉合兩種形式。這些觀察支持了中央螺旋和三聚體頂端在構象上是動態的觀點，可能受到穩定替代、抗體結合或其他因素的調節。其他病毒融合蛋白，包括RSV F、SARS-CoV-2刺突蛋白和流感HA，也觀察到了類似的“呼吸”現象。

为了更好地理解融合前構象上可能呈現的独特表位，我们对HSV-2 gB-G3和融合後HSV-2 gB（PDB：8RH1）結構进行了詳細的結構比較（圖S4）。首先，計算了兩種構象中每個殘基的相對可溶劑可及表面积（rSASA）值，并利用rSASA值的差異來可视化兩種構象間表麵的差异（圖S4B）。這種分析僅显示了少数幾個相邻殘基的表麵區域，主要位于DI靠近融合環的位置，在融合前構象中表現得更为可及。为了更好地理解在rSASA分析中可能不顯著的局部環境變化，我们还將每個構象中每個殘基10 ?范围内的所有殘基定義為“鄰域”，並使用Jaccard相似性度量來比較每個殘基鄰域的相似性（圖S4C）。每個殘基的可溶劑可及表積（SASA）差值和鄰域Jaccard相似性得分的圖进一步表明，許多融合前特異性的表麵主要位于DI靠近融合環的位置（圖S4D）。重要的是，这些區域靠近病毒膜，在天然HSV-2病毒粒子中可能不可及。这些分析支持了其他III類病毒融合蛋白的發現，表明融合前到融合後的構象變化主要是通过多個剛體運動來實現的，少數表位在一种構象中暴露而在另一种構象中被掩蓋。

为了比较體內融合前和融合後HSV-2 gB蛋白亞基疫苗誘發的中和抗體和T細胞反應，我们用兩劑（0.5 μg或2 μg）的HSV-2 gB-B1、gB-S6和gB-G3蛋白外域構造與鋁鹽或TLR4激動劑和脂質體（TLR4+liposome）聯合接種小鼠，并檢查了抗體和T細胞反應（圖S5）。與第2劑接種後第27天（約4周）相比，第42天（第2劑接種後2周）各疫苗抗原組之間的差異更加明顯（圖5A；表S2），因為所有接種組在第二次接種後都诱导了強勁的ELISA幾何平均滴度（GMTs）增強。此外，只有使用TLR4+liposome作為佐劑的接種組在統計上显示出顯著差異（圖5A）。值得注意的是，與gB-S6（2.3–7.3倍）或gB-G3（12.7–51.3倍）疫苗組相比，使用gB-B1融合後構造接種在第27天诱导的GMTs更高（表S2），但只有在使用TLR4+liposome作爲佐劑的接種組中才达到了統計显著性（圖5A）。gB-S6使用鋁鹽佐劑在第27天的ELISA GMTs也比gB-G3升高（2.2倍），但這種差異在統計上不顯著，且不如gB-B1和gB-G3接種組之間的差異顯著（表S2）。鑑於HSV-1和HSV-2 gB有約85%的序列相同性，我们还通過ELISA測定了對HSV-1 gB的血清抗體结合滴度（圖S6）。所有測試組均誘发了能識別HSV-1和HSV-2融合前gB的抗體，不同疫苗抗原組之間沒有統計上的顯著差異。

圖5 蛋白質接種後的抗體和T細胞反應
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(A–B) 抗體反應通過（A）ELISA量化HSV-2 gB結合滴度或（B）中和試驗量化HSV-2血清中和抗體滴度來表征，其中符號代表個體動物（n = 8），條形圖代表幾何平均值。統計數據在表中呈現，并使用雙因素ANOVA和多重比较進行分析。鋁鹽接種組的比較未顯示統計显著性，因此未在圖中显示。TLR4+liposome組的比較在表中報告，其中ns = 不顯著，?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.0001。CD4和CD8 T細胞反應在（C）和（D）中通過第42天（接種後2周）從脾細胞中分離的T細胞內細胞因子染色（ICS）來表征。產生任何Th1細胞因子（IFN-γ、IL-2和TNF-α）的T細胞的總頻率（n = 5）由符號表示，條形圖代表幾何平均值。統計分析使用雙因素ANOVA和多重比较進行。达到統計显著性的組別在圖中標出，其中????p < 0.0001。幾何平均值和幾何標準差（SD）的值是從5個個體動物計算得出的，除非另有说明。

(a) 几何平均值和幾何標準差的值是从4個個體動物計算得出的，因爲有一個動體的細胞因子產生T細胞水平不可檢測。

另見圖S5–S8；表S2。

为了进一步表征抗體反應，我們量化了免疫小鼠的血清中和抗體滴度。TLR4+liposome組的中和抗體滴度比鋁鹽佐劑組更高，而使用鋁鹽作爲佐劑在第27天時几乎没有可檢測到的中和抗體。然而，如ELISA滴度量化所觀察到的，所有佐劑組在第二次接種後中和抗體滴度都有所增加，且在使用TLR4+liposome作爲佐劑的接種組中統計上顯著差異（圖5B）。与ELISA观察到的趋势一致，gB-B1免疫接种诱导的中和抗体滴度高于gB-S6和gB-G3组，在TLR4+脂质体佐剂组中，这一差异在27天和42天时具有统计学意义（图5B）。与ELISA的GMT结果一致，gB-B1在42天时诱导的中和滴度增幅高于gB-G3疫苗（3.9-41.4倍），也高于gB-S6疫苗（0.8-1.9倍）（表S2）。gB-S6免疫接种在42天时也比gB-G3诱导了更高的血清中和滴度（范围：4.7-21.4倍；表S2），而gB-G3免疫接种无论使用何种佐剂或抗原剂量，在27天时都无法诱导出可检测到的血清中和滴度（图5B）。这些数据共同表明，gB-B1免疫接种通常比gB-S6和gB-G3蛋白抗原诱导更强的抗体反应，其中gB-G3的免疫原性最低。

为了确保对gB结合抗体的检测不会偏向于HSV-2 gB蛋白的融合前或融合后构象，我们使用gB-B1（融合后）或gB-G3（融合前）蛋白作为包被抗原，通过ELISA量化血清抗体滴度。使用gB-B1和gB-G3蛋白作为包被抗原的检测结果在幅度和模式上几乎相同（图S7），这表明关于gB-B1、gB-S6和gB-G3蛋白相对免疫原性的整体趋势并不受ELISA中使用的包被抗原构象的影响。

我们还通过肽池刺激和细胞内细胞因子染色（ICS）分析了蛋白免疫小鼠的脾脏CD4和CD8 T细胞反应，以检测Th1细胞因子的产生。明矾免疫在CD4和CD8 T细胞中诱导的细胞因子 production 非常弱或无法检测到，无论使用何种抗原进行免疫（图5C和5D）。相比之下，使用TLR4+脂质体的免疫组在所有抗原组中均诱导了强烈的CD4和CD8 T细胞细胞因子 production（图5C和5D）。与抗体反应的趋势类似，使用TLR4+脂质体的gB-B1蛋白免疫在CD4和CD8 T细胞中诱导了最高的细胞因子 production，相较于gB-S6和gB-G3组（图5C和5D）。这种效应在CD8 T细胞中更为明显，并具有统计学意义（图5D）。

总之，这些数据表明，使用融合后HSV-2 gB-B1蛋白的免疫接种比使用融合前HSV-2 gB-S6和gB-G3构建体具有更强的免疫原性。此外，gB-S6蛋白诱导的抗体滴度高于gB-G3蛋白免疫，但在诱导CD4或CD8 T细胞Th1细胞因子 production方面没有优势。

融合前稳定的HSV-2 gB亚单位疫苗比融合后的gB诱导了更多功能的抗体反应。为了进一步表征蛋白免疫的抗体反应，我们使用了接种后第2天（剂量2周后）的血清来量化所诱导抗体的HSV-2特异性Fc效应功能。我们研究了HSV特异性抗体促进mFcγRIV和mFcγRIII激活的能力，作为抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性的替代指标。mFcγRIII结合小鼠IgG1、IgG2a和IgG2b，而mFcγRIV仅结合mIgG2a和2b，这为候选疫苗诱导的IgG亚类提供了潜在的见解。mFcγRI（CD64）激活被用作抗体依赖性细胞吞噬（ADCP）活性的替代指标。mFcγRI是小鼠IgG2a的高亲和力受体，后者是人类IgG1的功能同源物。总体而言，使用融合前gB-S6和gB-G3的蛋白亚单位疫苗在明矾或TLR4+脂质体佐剂组中诱导的ADCC活性与使用融合后gB-B1构建体相当或更高（图S8A和S8B）。然而，我们仅在用明矾佐剂的融合前组中观察到mFcγRIII激活的统计学显著差异（p < 0.05）（图S8B）。同样，gB-S6在明矾和TLR4+脂质体佐剂组中诱导的ADCP活性也高于gB-B1，其中使用TLR4+脂质体佐剂的2 μg剂量gB-S6血清的mFcγRI激活显著增加（p < 0.001）（图S8C）。正如预期的那样，mFcγRIII能够响应IgG1以及IgG2a和IgG2b，导致比mFcγRIV更强的诱导效果。

为了进一步评估mRNA疫苗编码的融合前和融合后HSV-2 gB在小鼠中诱导的抗体反应，我们生成了HSV-2 gB-B1、gB-S6和gB-G3外域的mRNA序列，将其封装到脂质纳米颗粒（LNP）中并免疫小鼠。mRNA免疫组使用了低剂量（0.3 μg总mRNA）或高剂量（1.2 μg总mRNA），而蛋白质对照组使用了2 μg的gB-B1或gB-S6蛋白和TLR4+脂质体佐剂。mRNA免疫在所有组和时间点都诱导了强烈的HSV-2 gB结合抗体滴度。在27天或42天时，0.3 μg剂量下，gB-B1 mRNA免疫与gB-S6或gB-G3 mRNA免疫之间的GMT没有统计学显著差异（图6A；表S3）。在0.3 μg剂量下，任何时间点gB-S6和gB-G3 mRNA免疫之间的GMT也没有差异。在1.2 μg剂量下，gB-B1 mRNA与gB-S6或gB-G3 mRNA免疫之间的GMT也没有统计学显著差异（图6A；表S3）。在42天时，gB-B1 mRNA与gB-S6或gB-G3 mRNA免疫之间的GMT有统计学显著增加，但增幅分别为1.7倍和2.2倍（表S3）。与蛋白免疫实验观察到的结果一致，无论在ELISA中使用哪种gB-B1或gB-G3蛋白作为包被抗原，HSV-2 gB特异性抗体滴度的总体趋势都没有差异，这表明gB-B1、gB-S6和gB-G3 mRNA构建体的相对免疫原性并不受包被抗原构象的影响（图S9）。

mRNA免疫在27天时仅诱导了弱或无法检测到的血清中和抗体反应，而在第二次免疫后才检测到强烈的反应（图6B）。这与蛋白免疫形成对比，后者早在27天就诱导了强烈的血清中和滴度（图5B）。有趣的是，在27天或42天的任何剂量匹配比较中，gB-B1、gB-S6和gB-G3 mRNA免疫组之间的血清中和抗体GMT幅度没有统计学显著差异（图6B）。使用HiBiT和非HiBiT标记的mRNA构建体的体外细胞实验确认了gB-B1、gB-S6和gB-G3外域构建体之间的蛋白质表达相当（图S10），表明这些构建体在体内的免疫原性相当。此外，使用TLR4+脂质体的2 μg gB-B1蛋白免疫复制了早期研究的结果（图5B），显示中和抗体滴度高于使用TLR4+脂质体的2 μg gB-S6蛋白免疫（图6B；表S3），从而证实了之前的发现（图5B）。总之，这些数据表明，使用融合后gB-B1和融合前gB-S6及gB-G3构建体的mRNA免疫在体内诱导了相似的抗体反应。

mRNA免疫还诱导了强烈的CD4和CD8 T细胞反应（图6C和6D）。gB-B1、gB-S6和gB-G3 mRNA构建体之间的CD4反应相当（图6C）。gB-S6 mRNA免疫诱导的CD8 T细胞反应增强，在与gB-B1和gB-G3 mRNA组相比时具有统计学意义（分别为1.4倍和1.7倍）（图6D）。gB-B1与gB-S6蛋白质免疫之间的CD8 T细胞反应没有统计学显著差异（图6D），这与之前的蛋白免疫研究结果相反（图5D）。

总之，尽管在蛋白免疫实验中观察到gB-B1融合后抗原与gB-S6和gB-G3融合前抗原相比，诱导的结合抗体、血清中和滴度和CD8 T细胞有统计学显著增加（图5），但这些结果在使用mRNA表达这些构建体时并未再现（图6）。这些发现共同表明，与融合后的HSV-2 gB相比，融合前的HSV-2 gB构建体在小鼠中不能诱导更强的免疫反应。

HSV gB负责将病毒包膜与宿主细胞膜融合。该蛋白在HSV株之间高度保守，并且在HSV-1和HSV-2之间显示出显著的序列同源性。在自然感染过程中，gB诱导的强大抗体反应可以显著有助于病毒中和。鉴于gB在病毒进入中的核心作用及其作为疫苗抗原的重要性，阐明其天然、免疫学相关的融合前结构将不仅有助于我们理解HSV膜融合的分子机制，还有助于指导疫苗设计。在这里，我们发现了一组类似于之前在HCMV gB中识别的、用于稳定HSV-2 gB融合前构象的替代突变。这些突变成功稳定了HSV-2 gB-G3的融合前构象，揭示了似乎仅存在于HSV gBs中的额外结构细节。我们对HSV-2 gB的蛋白质工程工作进一步强调了跨亚基二硫键替换在稳定融合前构象中的重要性。这种策略最近也被应用于稳定EBV gB的融合前构象。McCool等人发现，对于B细胞和上皮细胞，使用融合前稳定的EBV gB免疫小鼠产生的中和滴度略有提高，而使用融合前EBV gB耗竭人类血清中的EBV阳性供体的IC50比使用融合后EBV gB耗竭时更低。基于这些发现，我们有理由怀疑完全融合前稳定的HSV-2 gB构建体可能通过展示融合前特异性表位来诱导更强的免疫反应，这些表位可以被免疫系统靶向以阻止病毒融合。

使用HSV-2 gB蛋白的免疫表明，融合后gB-B1诱导的结合和血清中和滴度以及CD8 T细胞反应高于融合前gB-S6和gB-G3构建体。另一方面，使用融合前gB-S6和gB-G3亚单位构建体的免疫诱导的抗体具有更高的Fc效应功能。临床前和临床证据表明，Fc效应功能对于抗HSV的抗体介导的保护（无论是中和抗体还是非中和抗体）都很重要。我们的数据表明，尽管中和滴度没有提高，但使用融合前gB构建体免疫提供的增强功能谱可能带来额外的好处。然而，当使用mRNA疫苗进行免疫时，这些趋势并未再现。这些差异可能是由于这两种疫苗模式在抗原递送、抗原持久性和蛋白质特性方面的固有差异造成的。实际上，之前在其他疫苗的研究中也观察到了mRNA和重组蛋白免疫之间的这些免疫原性差异。

无论抗原递送方式如何，我们的小鼠免疫研究并未显示融合前HSV-2 gB-S6或gB-G3与融合后gB-B1相比在诱导抗体结合滴度、中和抗体反应或CD8 T细胞反应方面具有优势。残基级别的SASA差异和邻域Jaccard相似性分析显示，许多融合前特异性表位主要位于靠近融合环的DI区域。下一代预融合前G蛋白抗原（pre-gB antigens）含有MPR结构，可能更好地呈现这些表位并提高免疫原性。最近对HSV-1 gB的研究发现了一种针对DIV、DI和DIII区域中和表位的特异性纳米抗体（Nb1_gbHSV）。重要的是，Nb1_gbHSV可以结合HSV-1和HSV-2的gB，这表明HSV-2的预融合前gB中存在保守的中和表位。此外，Nb1_gbHSV能够在不使用稳定突变的情况下成功将HSV-2 gB稳定在预融合构象，进一步表明中和抗体有可能直接针对病毒颗粒上的预融合前gB进行作用。另一种特异性纳米抗体是从接种了预融合稳定型HSV-1 gB构建物的小鼠体内分离出来的，该抗体能结合DI和DII之间的表位。目前尚不清楚人类是否能产生类似的针对预融合前gB的特异性抗体。

鉴于正在进行的抗体分离工作，针对预融合前gB构象的中和敏感表位似乎较为罕见，这表明可能需要采取额外策略来开发有效的HSV-2疫苗，包括展示多种抗原、多聚化以及免疫聚焦等技术。另外，Nb1_gbHSV纳米抗体以及小鼠特异性预融合前gB抗体在中和能力上并不比能够识别融合前后gB的抗体更强，这可能表明预融合特异性并不一定与中和能力相关。这一观察结果也与过去的疫苗临床试验结果一致，即gD-2和gB-2亚单位疫苗虽然能诱导出较高的中和滴度，但未能达到临床终点标准。将gB稳定在预融合构象——这是唯一预期能与gH/gL相互作用的构象——可能有助于形成gB/gH/gL复合体，从而成为有效的疫苗抗原。

总体而言，这些发现与近期研究结果一致，即保持疱疹病毒融合蛋白的预融合构象不足以引发比融合后构象更强的免疫反应。我们开发的HSV-2 gB预融合前外域稳定版本将有助于研究其他病毒表面蛋白之间的构象特异性相互作用，并分离出针对预融合前gB的特异性抗体，这些抗体可能对于开发有效的单克隆抗体疗法以治疗HSV-2感染具有价值。我们的研究结果表明，基于结构的HSV-2 gB预融合稳定化是可行的，但与许多I类融合蛋白不同，预融合稳定的gB并未带来更好的疫苗抗原效果。

**研究的局限性**
我们承认本研究存在几个局限性。首先，如图4所示，“预融合”构象可以包括多种相关构象。本文中提到的HSV-2 gB-G3结构与其他已发表的被认为处于预融合构象的疱疹病毒gB结构（包括全长HCMV和HSV gB蛋白）高度一致。其次，我们没有在接种疫苗后对HSV-1或HSV-2进行挑战实验。由于缺乏挑战实验，我们无法确定预融合和融合后构象之间的免疫原性差异是否会导致对HSV感染或疾病的防护水平不同。第三，我们未评估预融合稳定是否会在抗体谱型上产生差异。尽管数据显示无论疫苗组成如何，预融合和融合后构象之间的抗体结合滴度相当，但更详细的靶向表位分析将有助于我们更好地理解每种疫苗候选物的体液免疫反应差异，并指导进一步的工程策略，以更精确地引导免疫反应针对最具有中和敏感性的表位。最后，我们未研究每种疫苗候选物是否能产生能够阻断细胞间传播的抗体，而细胞间传播是HSV致病和免疫逃逸的关键机制。

**资源获取**
如需更多信息或资源请求，请联系主要联系人Jason S. McLellan（[e-mail]）。

**材料获取**
本研究中生成的所有独特/稳定试剂均可从主要联系人处获得，并附带完整的材料转让协议。

**数据和代码获取**
• 原子坐标和冷冻电镜图谱已分别存储在PDB和EMDB数据库中，相应的访问代码如下：预融合HSV-2 gB与2c和D48 Fab组分的复合物结构（PDB: 9ZWE, EMD-74907）。
• 本文未报告原始代码。
• 如需重新分析本文中的数据，可向主要联系人咨询以获取额外信息。

**致谢**
我们感谢McLellan实验室的成员对手稿提供的有益意见，以及UT Austin大学Sauer结构生物学实验室的Axel Brilot博士和Evan Schwartz博士在冷冻电镜数据收集方面提供的帮助。感谢Marco Blanco制备LNP颗粒，以及Uijin Jeong和Silveria Rodriguez进行的ELISA和中和实验。同时感谢德克萨斯大学自然科学学院和德克萨斯癌症预防与研究所提供的支持。

**作者贡献**
概念设计与开发：M.R.S., D.Y.M., P.O.B., L.Z., E.D., D.W., 和 J.S.M.
调查与可视化：M.R.S., D.Y.M., E.N., P.O.B., Y.S., C.W., M.D.S., N.V.J., N.T., W.A.R.（第二作者），J.S.M.
撰写与编辑：M.R.S., D.Y.M., D.W., J.S.M.
监督：E.D., D.W., J.S.M.

**利益声明**
D.Y.M., E.N., Y.S., C.W., N.T., W.A.R.（第二作者），L.Z., E.D., D.W. 是美国新泽西州Rahway市Merck & Co., Inc.的员工，并持有该公司股票。M.R.S. 和 J.S.M. 是美国专利申请号63/550,303的发明人，该专利名为“预融合稳定的HSV2 gB蛋白”，申请日期为2024年2月6日。含有Fab的洗脱液进一步通过SEC（尺寸排阻色谱）在HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱（Cytiva）上进行纯化，该柱子已在20 mM Tris-HCl pH 8.0、200 mM NaCl和0.02%（w/v）叠氮化钠中平衡。最终的蛋白质制剂使用Amicon Ultra离心过滤器（MilliporeSigma）浓缩至1–10 mg/mL，然后在液氮中快速冷冻，并储存于-80°C。

### 差示扫描荧光测量法
反应在白色壁的96孔PCR板（VWR）中制备，每孔含有0.45 mg/mL的蛋白质和15× SYPRO Orange（ThermoFisher；DMSO中的5,000倍浓缩液），总体积为50 μL。工作SYPRO Orange溶液在468 nm处的吸光度为0.295，使用NanoDrop One分光光度计（ThermoFisher）和1 mm的路径长度进行测量。板子被密封后放入LightCycler 480 II仪器（Roche）中，该仪器配备了100 W的氙气激发灯。在温度从25°C升至90°C的过程中，使用465 nm激发滤光片（25 nm半带宽）和580 nm发射滤光片（20 nm半带宽）监测荧光。荧光数据作为荧光强度对温度的一阶导数（dF/dT）绘制出来，以确定热转变中点（Tm）。

### 阴性染色电子显微镜技术
纯化并浓缩的HSV-2 gB-B1蛋白与Fab 2c、HSV010-13和BMPC-23以2:1的摩尔比在室温下孵育15–30分钟。然后将复合物稀释至SEC缓冲液中的最终浓度0.04 mg/mL，并立即应用到涂有碳稳定Formvar膜的400目铜网格上（Electron Microscopy Sciences）。网格用2%（w/v）甲胺钨酸盐（Nano-W；Nanoprobes）染色，并使用JEOL NEOARM透射电子显微镜在200 kV下成像。显微照片的标称放大倍数为50,000倍（相当于2.16 ?的像素大小），使用OneView CMOS相机（Gatan）和Digital Micrograph软件（Gatan）以4k × 4k模式拍摄。图像导入cryoSPARC（Structura Biotechnology）进行对比度转移函数（CTF）估计、颗粒挑选和二维分类。

### 冷冻电镜样品制备和数据收集
冷冻电镜网格（CF-400 1.2/1.3；Electron Microscopy Sciences）在使用PELCO easiGlow系统以15 mA的电流下进行30秒的辉光放电处理后，再进行样品应用。样品在含有2 mM Tris-HCl pH 8.0、200 mM NaCl、0.02%（w/v）叠氮化钠、3%（v/v）甘油和0.01%（w/v）amphipol A8-35的EM缓冲液中制备。对于gB-S2复合物，gB-S2与1.5倍摩尔量的2c Fab和1.2倍摩尔量的D48 Fab在EM缓冲液中孵育30分钟，最终浓度为2.1 mg/mL。在玻璃化之前，立即加入CHAPS（VitroEase Buffer Screening Kit；ThermoFisher）至最终浓度0.1× CMC。将3 μL的复合物液滴加到每个网格上，双膜印迹后，使用Vitrobot Mark IV（ThermoFisher）在100%湿度和4°C下以3秒的印迹时间和-1的印迹力进行液氮 plunge-freezing。对于gB-G3复合物，gB-G3与1.2倍摩尔量的2c和D48 Fab混合至最终浓度3.5 mg/mL，在4°C下孵育30分钟，然后补充CHAPS至最终浓度0.2× CMC。将3微升的复合物液滴加到辉光放电的网格上，双膜印迹后，在相同的条件下进行液氮 plunge-freezing，但印迹时间为5秒，印迹力为6。

冷冻电镜数据在FEI Titan Krios透射电子显微镜（ThermoFisher）上收集，该显微镜配备了K3直接电子探测器（Gatan），操作电压为300 kV。显微照片的标称放大倍数为105,000倍，对应的校准像素大小为0.83 ?。gB-S2复合物共收集了17,634张显微照片，所有照片均以30°倾斜角度拍摄。gB-G3复合物共收集了11,000张照片，其中5,182张以30°倾斜角度拍摄，5,818张不倾斜。数据采集使用SerialEM v4.1软件进行。

### 冷冻电镜数据处理、模型构建和精修
基于补丁的运动校正、基于补丁的CTF估计、显微照片处理、颗粒挑选和二维分类最初在cryoSPARC Live中完成。选定的显微照片和颗粒随后导出到cryoSPARC v4.5中进行额外的二维分类、从头算重建、异质性精修、均匀性精修以及最终类别的非均匀性精修。初始模型使用ModelAngelo构建，gB-G3结构的迭代模型构建和精修则在Phenix、Coot和Isolde中进行。埋藏表面积和相互作用残基的计算使用了欧洲生物信息学研究所的Protein Interfaces, Surfaces and Assemblies (PISA)服务器。结构图在ChimeraX中制作。数据收集和精修统计信息见表S1。

### 疫苗配方
蛋白质疫苗的最终抗原剂量为0.5或2 μg，分别配合25 μg的明矾或2.5 μg的TLR4+脂质体佐剂。编码gB-B1、gB-S6和gB-G3外域的线性mRNA构想在Merck & Co., Inc.（西点，PA）生产。mRNA编码序列使用Merck & Co., Inc.（Rahway，NJ，美国）的算法进行了密码子优化。gB-B1、gB-S6和gB-G3的质粒模板由供应商（GenScript，美国）合成，并进行线性化以用于体外转录（IVT）。IVT后，产生的mRNA通过寡(dT)亲和色谱（Sartorius）纯化。所有三种mRNA的表达在细胞基测试中得到了确认（图S10）。线性mRNA疫苗的最终RNA剂量为0.3或1.2 μg，封装在脂质纳米颗粒（LNPs）中。LNPs的制备和表征方法如前所述。LNPs由以下成分按摩尔比58:30:10:2组成：可电离氨基脂质（(13Z,16Z)-N,N-二甲基-3-壬基二十二碳-13,16-二烯-1-胺）、二硬脂酰磷脂胆碱（DSPC）、胆固醇和聚乙二醇2000-二肉豆蔻酰甘油（PEG2000-DMG）。

### 脂质纳米颗粒大小测定
脂质纳米颗粒的大小通过DynaPro颗粒粒度仪（Wyatt Technology，Santa Barbara，CA）的动态光散射法测定，所有制剂的粒径均在80–100 nm范围内。通过梯度反相超高效液相色谱方法测定了LNPs中四种脂质的浓度。此外，通过SYBR金荧光法测得的RNA包封效率对于所有测试的LNP制剂均超过95%。

### 小鼠免疫
我们使用了从Charles River Laboratories购买的9周大的雌性BALB/c小鼠。小鼠可以自由摄取食物和饮水，实行12小时的光照/黑暗周期。所有动物实验均获得了Merck & Co., Inc.（Rahway，NJ，美国）的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。小鼠在第一周和第四周接受两次疫苗肌肉注射。在注射后第27天（约4周，PD1）和第42天（注射后2周，PD2），采集血清样本进行抗体分析。在第42天还采集了脾脏样本用于T细胞分析。

### 抗体ELISA
HSV gB抗体结合滴度通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进行评估。简要来说，HSV-1或HSV-2 gB蛋白以1 μg/mL的浓度包被在384孔MaxiSorp测定板上（Thermo Fisher，目录号#460518），在4°C下过夜。第二天，板子被洗涤并用含有0.05% TWEEN 20（PBST）的3%非脂干牛奶封闭，然后加入稀释的血清。将连续稀释的血清（初始稀释50倍，4点滴定）或小鼠抗HSV-2 gB单克隆抗体作为阳性对照，在22°C下孵育2小时。随后加入浓度为0.25 μg/mL的辣根过氧化物酶结合的山羊抗小鼠IgG，在22°C下孵育1小时，然后使用化学发光底物（等量的Luminol/增强剂溶液和稳定过氧化物溶液）显色。使用EnVision多功能读取器（PerkinElmer）读取发光值。通过插值公式根据指定临界点上方和下方的数据（即50,000）确定插值终点滴度。插值终点滴度在Prism（GraphPad Software）中以几何平均值+95%置信区间绘制。

### HSV-2血清中和试验
血清中和抗体滴度通过使用HSV-2-GFP报告病毒（菌株MS，由罗格斯大学Hua Zhu实验室生产）和baby hamster kidney-21（BHK-21）细胞（ATCC，目录号CCL-10）的血清中和测定进行评估。小鼠血清样本在使用前在56°C下热灭活30分钟。血清样本在不含血清的Eagle’s Minimum Essential Media（EMEM）中以1:20的比例稀释，并加入培养基补充物和5%（v/v）的rabbit complement（Cedarlane，目录号CL3441）。HSV-2-GFP报告病毒以1.0 × 10^4 plaque-forming units的浓度加入血清样本和对照抗体中。在37°C下孵育1小时后，向每个孔中加入4 × 10^3个BHK-21细胞。病毒中和在37°C下进行18–20小时，直到使用Acumen（SPT Labtech）高通量成像仪定量GFP阳性焦点。为了确定半最大中和滴度（NT50），根据以下公式将每个孔中的GFP荧光信号转换为百分比：100-((样本-MEAN细胞)/(MEAN病毒仅)-MEAN细胞仅)*100。

### 细胞因子分析
在小鼠免疫后第42天，通过刺激小鼠脾脏细胞评估Th1细胞产生的细胞因子。从单个小鼠的脾脏中制备单细胞脾脏悬液。红细胞裂解后，将1–2 × 10^6个细胞接种到圆底96孔板中，并在37°C下用含有2 μg/mL的HSV-2 gB蛋白肽池（15个表位，有11个氨基酸重叠；JPT Peptide Technologies GmbH，柏林，德国）或无肽阴性对照（0.1% dimethyl sulfoxide v/v，Sigma-Aldrich目录号D2650）以及1.25 μg/mL的可溶性anti-mouse CD28（克隆37.51，BD Biosciences目录号557393）和1.25 μg/mL的可溶性anti-mouse CD49d（克隆R1-2，BD Biosciences目录号553154）刺激6小时。最后5小时加入Brefeldin A（Sigma-Aldrich目录号B7651）以10 μg/mL的浓度。使用EDTA（乙二胺四乙酸）停止反应，细胞在4°C下过夜保存，以备免疫染色。

### 细胞因子染色和流式细胞术
刺激后的脾脏细胞首先进行表面标记物染色以识别T细胞群体，然后进行ICS（免疫细胞化学）以识别Th1细胞因子肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素-2（IL-2）和干扰素γ（IFNγ）。使用的抗体和染色剂包括：LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain（Invitrogen目录号L34955）；CD3-APC Cy7（克隆145-2C11，BD Biosciences目录号557596）；CD4-PE（克隆RM4-5，BD Biosciences目录号553049）；CD8α-BUV395（克隆53–6.7，BD Biosciences目录号563786）；TNFα-PE Cy7（克隆MP6-XT22，BD Biosciences目录号557644）；IL-2-PCF594（克隆JES6-5H4，BD Biosciences目录号554413）。表面和细胞内染色在Mouse Fc Block（克隆2.4G2，BD Biosciences目录号553142）存在下进行。ICS按照制造商的说明使用Cytofix/Cytoperm缓冲液（BD Biosciences目录号554722）和Perm/Wash Buffer（BD Biosciences目录号554723）进行，然后用BD Stabilizing Fixative（BD Biosciences目录号338036）固定细胞，随后在Fortessa X-50流式细胞仪（BD Biosciences）上进行流式细胞术分析。数据使用FlowJo?软件（BD Biosciences，版本10.8.1）进行分析，并在Prism（GraphPad软件）中绘制。

### 表位结构分析
为了结构比较融合前（G3）和融合后HSV-2 gB结构上的潜在表位，我们首先从Protein DataBank下载了融合后构象的模型（PDB ID：8RH1），并移除了结合的Fab。链ID和残基编号被修改为在融合前和融合后构象之间保持一致。在每种构象中，使用BioPython SASA模块中的Shrake Rupley算法计算每个残基的溶剂可及表面积（SASA）值。每种构象中的每个残基的SASA值被标准化为该残基类型的最大实验确定值，从而得到一个相对比例（rSASA），范围从0（完全埋藏）到1（完全可及）。为了比较两种构象，计算每种构象中的每个残基的rSASA值之差（融合前 - 融合后）。在这个指标中，得分1表示残基在融合前构象中完全可访问，在融合后构象中完全被埋藏；得分-1表示残基在融合后构象中完全可访问，在融合前构象中完全被埋藏；得分为0表示该残基在这两种构象中都具有相同的可访问性。除了rSASA分析之外，我们还测量了每种构象中每个残基周围10 ?（Cα-Cα）范围内的所有其他残基，并使用Biopandas将这些残基定义为该残基的邻域。对于每个残基，我们通过Jaccard相似性度量方法比较了两种构象中邻域列表的相似性，其中得分1表示列表完全相同（两种构象中的邻域相同），得分0表示列表之间没有相似性。rSASA值和两种构象之间的邻域Jaccard相似性被存储在PDB文件的B-factor列中，并通过PyMOL软件中的spectrum命令进行可视化。

**293T细胞中的HiBiT测定**
HSV-2 gB变体B1、S6和G3的mRNA通过IVT合成，并使用Monarch? Spin RNA Cleanup Kit (500 μg) (NEB, catalog# T2050)进行纯化。为了便于表达分析，每个gB构建体上融合了一个11个氨基酸的HiBiT标签（Promega）。HiBiT标签与其配体蛋白LgBiT结合，重新组成一个活性荧光素酶。在底物存在的情况下，所产生的生物发光信号定量反映了标记蛋白质的表达水平。对于转染实验，根据制造商的说明，将50 ng的HiBiT标记的B1、S6或G3 mRNA与Lipofectamine MessengerMax (Invitrogen, catalog# LMRNA150)混合使用。mRNA-Lipofectamine复合物在10个稀释点上进行连续稀释，然后用它们来转染293细胞。转染后48小时内每小时记录一次生物发光读数，以分析表达动力学（Promega, catalog# N2572）。每种构建体的表达水平被绘制为随时间变化的剂量-反应曲线。计算曲线下面积（AUC）以量化整体表达量。为了特异性评估细胞内表达，使用了内源性稳定表达LgBiT的293细胞，使发光信号代表细胞内的HiBiT标记蛋白质水平。对于细胞外表达分析，则使用亲本293细胞；向培养基中添加外源性LgBiT蛋白（Promega, catalog# N401A），以便仅检测分泌的HiBiT标记蛋白质。

**293F细胞中的Western Blot**
蛋白质表达通过基于毛细管的免疫测定方法进行分析，使用的是Jess Automated Western Blot System (ProteinSimple, USA)。简而言之，转染后24小时，使用Pierce IP Lysis buffer (ThermoFisher, cat #87787) 和蛋白酶抑制剂混合物 (ThermoFisher, cat #78442) 溶解FreeStyle 293-F细胞。使用BCA测定法测量蛋白质浓度（ThermoFisher, cat #23227）。总蛋白质通过total protein detection模块（ProteinSimple, USA, cat #DM-TP01）检测，HSV-2 gB蛋白则使用Merck & Co., Inc. (West Point, PA) 生产的一抗和anti-mouse detection模块（ProteinSimple, USA, cat #DM-002）进行检测。样品通过毛细管试剂盒（ProteinSimple, USA, cat #SM-W004）分离，并使用Replex模块（ProteinSimple, USA, cat #DM-002）在同一操作中同时检测HSV-2 gB和总蛋白质。数据在Compass for Simple Western软件（Bio-Techne, USA）上进行分析。

**抗体依赖的细胞毒性及细胞吞噬作用测定**
mFcγRIV和mFcγRIII的激活作为抗体依赖的细胞毒性（ADCC）的生物标志物，而mFcγRI的激活作为抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）的生物标志物。HSV特异性的FcγR诱导的ADCC和ADCP活性通过mFcγRIV、mFcγRIII和mFcγRI ReporterBioassays（Promega, cat #M1211、CS1779B08和CS354405）按照制造商的说明进行测量，或根据之前的方法稍作修改后进行测定。简而言之，Vero E6细胞被接种在96孔平底白色孔板上（Corning, #3917），并在37°C和5% CO2条件下用HSV-2 MS菌株感染一夜（MOI为1 PFU/细胞）。这些靶细胞与1:10稀释的8% Low IgG serum-ADCC Assay Buffer混合后在37°C和5% CO2条件下孵育30分钟。稳定表达mFcyRIV或mFcyRIII的Jurkat细胞的激活被用作ADCC活性的替代指标；而表达mFcyRI的Jurkat细胞的激活被用作ADCP活性的替代指标。对于这两种测定，7 × 10^4个细胞与靶细胞在37°C和5% CO2条件下孵育6小时，然后测量NFAT驱动的荧光素酶表达。mFcγRIV、mFcγRIII和mFcγRI的活性通过Bio-Glo Luciferase Assay系统（Promega, cat #G7941）检测。孵育后，向每个孔中加入75 μL的Bio-Glo Reagent并在室温下孵育25分钟。随后使用Envision Multimode Plate Reader（PerkinElmer, Waltham, MA, USA）在发光模式下测量发光强度（每个孔的积分时间为1秒）。使用以下公式计算FcγR诱导的倍数：Fold FcγR induction = (含效应分子和靶细胞的血清样本的荧光强度 - 背景）/ (不含血清的对照组的荧光强度 - 背景)。

**定量和统计分析**
对于小鼠免疫研究，图中的数据以单个动物的数值表示，并给出了几何平均值。统计分析使用Prism软件（GraphPad，版本10.2.2）进行，采用普通单因素或双因素方差分析，并进行Tukey多重比较测试，之后分别使用Dunnett或?idák校正。p < 0.05表示统计学上的显著差异。对于仅蛋白质的免疫研究，使用明胶作为佐剂的组间比较未达到统计显著性；图中仅报告了使用TLR4 +脂质体作为佐剂的组间的比较结果。对于mRNA和蛋白质免疫研究，表格和图中报告了指定时间点内mRNA或蛋白质免疫组间的比较结果。

**补充信息（2）**
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- PDF (23.22 MB)：文档S2（文章及补充信息）