《Fermentation》：Valorization of Whey Permeate Through Kefir Fermentation: Aflatoxin B1 Binding and Cytoprotective Effects
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黄曲霉毒素B1（AFB1）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A. parasiticus）产生的强致癌代谢产物，对食品安全构成重大威胁。常规去污方法成本高昂或效果不佳。生物脱毒已成为一种有前景的替代方案。开菲尔是一种发酵乳饮料，由乳
黄曲霉毒素B1（AFB1）是由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A. parasiticus）产生的强致癌代谢产物，对食品安全构成重大威胁。常规去污方法成本高昂或效果不佳。生物脱毒已成为一种有前景的替代方案。开菲尔是一种发酵乳饮料，由乳酸菌（LAB）和酵母菌组成，已证实其具有抗真菌特性。本研究评估了乳清渗透物（WP）作为开菲尔微生物发酵底物的可行性，并评估了其AFB1结合能力。在WP中培养的开菲尔微生物支持活跃的发酵，乳酸菌达到8.47 log CFU/mL，酵母菌达到7.57 log CFU/mL，同时伴随乳糖消耗和有机酸产生。研究人员在多种条件下评估了13株开菲尔来源微生物及开菲尔总微生物群落结合AFB1的能力。所有微生物均表现出AFB1结合能力，尽管结合程度取决于菌株、生长培养基、pH、微生物浓度和毒素浓度。在WP中生长的开菲尔总群落观察到最高结合率。开菲尔总群落和植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）CIDCA 83114的结合随时间保持稳定，且与活力和疏水性无关。开菲尔微生物对AFB1的结合显著降低了AFB1诱导的HepG2细胞细胞毒性。这些发现表明，WP可被增值为含有强AFB1结合和细胞保护特性微生物的高附加值发酵产品。
**开菲尔发酵乳清渗透物的增值化研究：AFB1结合与细胞保护效应**
真菌毒素是丝状真菌产生的次级代谢产物，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）主要由黄曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉（A. parasiticus）产生，是迄今鉴定出的最强肝癌致癌物，被国际癌症研究机构（IARC）列为1类人类致癌物。全球每年约25%的粮食作物估计受到真菌毒素污染，对食品安全和国际贸易构成严重威胁，而气候变化正通过改变温度和湿度条件进一步加剧产毒真菌的扩散。常规物理化学去污方法往往成本高昂、效果有限，甚至损害食品品质，因此生物脱毒成为备受关注的控制策略。乳酸菌（LAB）和某些酵母菌已被证实能通过细胞壁组分的物理吸附作用结合AFB1。开菲尔是传统发酵乳饮料，其微生物群落包含LAB、醋酸菌和酵母菌，具有益生特性和抗真菌能力。乳清渗透物（WP）是奶酪乳清脱蛋白过程中产生的大量富含乳糖的副产品，若未合理利用则成为环境污染源。已有研究表明某些LAB和开菲尔分离菌株具有AFB1结合能力，但开菲尔微生物以WP为底物培养后能否在实现副产品增值的同时保留脱毒特性尚属未知。针对这一空白，研究人员假设在WP中培养开菲尔微生物既能促进乳品副产品增值，又能产生通过毒素结合与细胞保护机制减轻AFB1毒性的微生物生物量，并据此开展了系统研究。研究结果证明WP可被转化为含有强AFB1结合和细胞保护特性微生物的高附加值发酵产品，为食品和饲料中AFB1生物缓解提供了低成本替代方案。该论文发表在《Fermentation》。
研究人员开展研究主要采用了以下关键技术方法：使用开菲尔粒CIDCA AGK1（来自阿根廷食品科学与技术研发中心CIDCA保藏菌株）活化后接种于无菌乳清渗透物（WP，阿根廷Ilolay公司）中30°C发酵24 h；菌株来自CIDCA保藏中心及日本微生物保藏中心（JCM）等商业来源；采用高效液相色谱（HPLC）结合荧光检测定量未结合AFB1，HPLC离子交换柱测定乳酸和乙酸浓度；通过n-十六烷烃两相分配法测定微生物表面疏水性；细胞保护实验使用人肝癌细胞系HepG2（来源于阿根廷IMBICE，ATCC HB-8065），以MTT法（线粒体琥珀酸脱氢酶活性）和乳酸脱氢酶（LDH）释放率双指标评估细胞活力与膜损伤。
**3.1 开菲尔粒生长与乳清渗透物发酵**：发酵引起WP化学组成显著变化，乳酸从8.9 mM升至148.4 mM（增加16倍以上），乙酸从6.7 mM升至43.9 mM（约6.6倍），乳糖从3.33%降至2.23%，可溶性固形物（°Brix）从5.30%降至4.04%。开菲尔粒在WP中保持典型菜花样结构但略小、更透明。发酵后LAB达8.47 log CFU/mL、酵母达7.57 log CFU/mL，均超过阿根廷法规对发酵制品的要求。
**3.2 总开菲尔群落及分离微生物对AFB1的结合**：所有测试微生物均表现一定结合能力但呈显著菌株依赖性。在WP中生长的总开菲尔群落结合量最高（105.5 ng/mL），超过任何单一菌株。L. kefiri菌株无法在WP中生长，而所有Lpb. plantarum菌株均能生长但活菌数低于MRS。Lpb. plantarum CIDCA 83114结合能力最高（MRS和WP中分别为88.9和78.1 ng/mL），且MRS与WP生长组间无显著差异。酵母中S. cerevisiae CIDCA 8112结合能力最高（84.7和75.7 ng/mL），S. boulardii几乎无结合作用。按细胞数归一化后，部分酵母的单细胞结合效率（最高35.67×10?? ng/CFU）远高于乳酸菌（≤0.63×10?? ng/CFU）。疏水性与结合能力无显著相关（Spearman ρ = ?0.166, p = 0.46）。
**3.3 活力、孵育时间、pH和浓度对AFB1结合的影响**：热处理（72°C，30 min）不显著影响结合，表明结合不依赖细胞代谢活性。总群落和Lpb. plantarum CIDCA 83114在中性pH（7.1）下结合最强，K. marxianus CIDCA 8154在pH 5.1时最高；pH 2.1虽显著降低部分微生物活力，但结合能力得以维持。结合量随毒素浓度（150~5000 ng/mL）和微生物浓度增加而增加，线性回归证实显著正相关（R2分别为0.995、0.883和0.864，p < 0.05）。时间稳定性实验中，总群落和Lpb. plantarum CIDCA 83114在48 h内结合稳定，而K. marxianus CIDCA 8154结合量从40.9 ng/mL逐渐降至13.5 ng/mL，表明其结合较弱且部分可逆。
**3.4 对AFB1细胞毒性的保护作用**：单独暴露于总开菲尔群落对HepG2细胞无内在毒性。AFB1以浓度依赖性方式降低细胞活力：150 ng/mL时活力降至75.2%，300 ng/mL时降至52.9%；LDH释放分别增至68.4%和96.4%。灭活总群落与AFB1预孵育后，150 ng/mL处理组细胞活力恢复至97.8%，300 ng/mL组恢复至91.4%；LDH释放分别降至52.4%和57.2%，证实毒素结合有效降低了AFB1的生物可利用性并保护了细胞代谢活性和膜完整性。
讨论指出，WP虽营养含量相对较低，但足以支持开菲尔微生物旺盛生长，且发酵产生的有机酸积累与抗真菌活性相关。总群落结合能力优于任何单一菌株，可能与细菌-酵母菌群互作、共聚集及开菲兰等胞外聚合物有关。结合与活力无关说明细胞壁组分（肽聚糖、磷壁酸、β-葡聚糖、甘露糖蛋白等）是主要吸附位点，热处理可能通过改变细胞壁结构暴露额外结合位点。pH效应反映AFB1与微生物表面基团电离状态的变化。K. marxianus CIDCA 8154结合的可逆性提示不同微生物的毒素结合稳定性差异显著。研究结论为：开菲尔发酵是将乳清渗透物转化为功能性微生物生物量的有效增值策略；总开菲尔群落表现出最高的AFB1结合能力，Lpb. plantarum CIDCA 83114的结合随时间稳定；灭活后及酸性条件下脱毒潜力基本保留，支持吸附为主导机制；HepG2细胞中AFB1诱导细胞毒性的降低证实了毒素结合的生物学意义。该低成本微生物生物量可为食品和饲料系统中AFB1的生物缓解提供替代方案。
