母亲与成年女儿阴道微生物组中的物种和菌株共享

《Cell Reports》：Species and strain sharing in the vaginal microbiome of mothers and their adult daughters

　　

## 亮点

- 母亲与成年女儿在阴道微生物组物种谱系上具有相似性
- 这种相似性延伸至菌株水平，尤其是主要的阴道乳杆菌
- 仅凭出生时传播无法完全解释这种菌株共享现象

## 摘要

阴道微生物组对女性健康至关重要。然而，其建立过程、个体间差异及动态变化仍知之甚少。在此，我们利用大规模公民科学项目Isala中成年母女对的样本，在物种和菌株水平上研究细菌的关联关系。我们采用包含16S rRNA谱系比较的质量控制流程进行宏基因组测序，并结合针对性培养，评估代际微生物组共享情况。在物种水平上，女儿的阴道微生物组与其亲生母亲的相似性显著高于与无亲属关系的母亲。在*乳杆菌脆柔菌*（*Lactobacillus crispatus*）的优势种状态上，母女之间存在强烈的相关性。宏基因组和分离菌株基因组的菌株水平分析揭示了*L. crispatus*的种内多样性，同一宿主中可观察到多达两个菌株，并支持代际阴道细菌共享现象。共享的*L. crispatus*菌株中的单核苷酸多态性（SNV）计数与女儿年龄之间无相关性。综合而言，这些发现表明，母体传播、宿主因素及（共享）环境共同塑造了阴道微生物组，为理解阴道微生物组的生态动态提供了根本性洞见，并为基于乳杆菌的应用前景提供了视角。

## 引言

理想的阴道微生物组对女性的生殖健康和整体健康至关重要，其益处还延伸至伴侣和子女。尽管意义重大，但影响其建立和动态变化的因素仍在逐步揭示中。肠道微生物组在这方面理解更为深入——其最早期的定殖菌群部分来源于母体肠道和阴道微生物组，包括双歧杆菌（*Bifidobacterium*）、普雷沃菌属（*Prevotella*）和乳杆菌属（*Lactobacillus*）等。阴道微生物组对这一"种子"肠道微生物组的贡献似乎是短暂的，出生一周后，如*L. crispatus*等乳杆菌在婴儿肠道中迅速降至检测水平以下，很可能被母体肠道菌群成员所取代。对于阴道微生物组而言，母体获得菌株的存在及其在生命各阶段的潜在持续性仍不明确。初潮前，阴道微生物组组成似乎较为多样，以厌氧菌为主，如普雷沃菌属和链球菌属（*Streptococcus*）。然而，由于在年幼时进行私密采样存在困难，这一阶段的研究仍然不足。据我们所知，目前仅有一项关于母女阴道菌株共享的研究，该研究对美国非裔美国人进行宏基因组测序，比较了母亲与其青春期/成年女儿之间的物种和菌株，并发现了家族内和家族间的部分菌株共享实例。

在育龄期女性中，平衡的阴道微生物组通常表现为物种多样性较低，以乳杆菌属占主导地位，尤其是*L. crispatus*、*L. iners*、*L. gasseri*和*L. jensenii*。这种乳杆菌在人类阴道中的主导地位通常在初潮后出现，与青春期雌激素水平升高相吻合。雌激素刺激上皮细胞释放糖原，为乳杆菌提供能量来源。这些产乳酸的细菌在阴道中形成低pH环境，通过将阴道上皮细胞脱落的糖原代谢为乳酸，从而抑制致病微生物。有趣的是，乳杆菌群体和其他细菌物种一样表现出种内多样性（在基因内容方面），这在宿主内尤其值得探索，反映了功能潜力的差异，如抗菌肽的产生。此外，没有阴道不适症状的女性也可能拥有多样性更高或由非乳杆菌种属占主导的阴道微生物组，其中已充分记录的金黄色加德纳菌（*Gardnerella vaginalis*）即为其中之一。尽管在健康女性中频繁检测到加德纳菌，但其益处并不明确，因为它可产生毒力因子并破坏阴道生态系统，同时产生的乳酸少于阴道乳杆菌。

除了年龄和激素波动外，生育史、避孕方式、性活动以及月经用品使用等多种生物学和生活方式因素已被证实会影响健康成年女性的阴道微生物组。综合而言，这些因素在我们的Isala项目第一个大规模队列中解释了微生物组10.4%的变异。该队列主要以乳杆菌属占主导（78%的参与者）。虽然10.4%表明已知生活方式和行为变量具有相当的影响力，但这一相对温和的百分比暗示还存在其他未知因素，如遗传和社会关系所捕获的因素，可能在建立和塑造阴道微生物组中发挥作用。其中一个决定因素是个体间的微生物传播，这一概念在肠道微生物组中已被广泛认可，但在阴道生态位中几乎被忽视。研究个体间细菌的传播和共享需要菌株水平的分辨率。当前方法通常依赖于仅基于标记基因的基因组比较，或映射至代表性/参考基因组或宏基因组组装基因组（MAGs），这限制了可重复性和可解释性。此外，微生物学领域对于何为"共享菌株"缺乏共识，在此方面通常使用较为武断的阈值。

在此，我们研究了成年母女是否在其阴道微生物组中共享物种和菌株，以及这种共享与关于微生物稳定性和可能的自出生起延续至生命后期的传播预期的契合程度。为此，我们分析了参与Isala项目的成年母女对样本，使用宏基因组和通过针对性培养获得的分离菌株基因组。此外，我们还对前述非欧洲队列中母亲与青春期/成年女儿的公开阴道宏基因组进行了重新分析，以在物种和菌株水平上考察细菌关联关系。我们通过针对阴道分类群和我们所研究的青春期/成年女性人群的菌株水平阈值来定义菌株共享。尽管垂直传播的概念常被用于微生物组研究中，我们在此研究阴道微生物组时刻意避免使用这一术语。我们采用"菌株共享"这一术语，因为我们无法回溯收集出生时的婴儿样本，而且该术语对观察到的菌株共享事件的方向性更为中性。我们研究了在成年后期代际物种和菌株水平共享的程度，这一阶段仍存在认知不足，且与生殖健康及其他阶段（包括绝经期）特别相关。

## 结果

### 母亲与成年女儿的阴道微生物组在物种水平上表现出显著相似性

在我们此前建立的Isala公民科学项目的第一个佛兰德队列中，超过3,300名女性采集了阴道拭子样本。在该队列中，35名女性自愿表示与母亲一起参与。这使我们能够研究家族内外的阴道微生物组相似性。为了在更高的分类学分辨率下研究这种相似性，我们从这些参与者的阴道拭子样本中先前提取的DNA（最初用于16S rRNA分类谱系分析至亚属水平）进行了深度宏基因组测序，每个样本高达1.5亿条reads（45 Gb）。经过质量控制并随后移除单一样本（即没有对应高质量女儿样本的母亲样本，或反之）后，我们在35对母女中保留了23对。这一质量控制步骤对于降低实验室样品处理过程中交叉污染的风险至关重要。这23对对应于42个高分辨率宏基因组，其中包括两位拥有不止一个女儿的母亲（F04和F17；图1B）。每个宏基因组的reads计数中位数为6,691,242（四分位距：10,616,498）。母亲（标记为"M"；n = 19）的年龄在45至68岁之间，女儿（标记为"D"；n = 23）在采样时的年龄为18至32岁（图1A）。其中12位母亲（63.2%）报告为绝经后状态。在女儿中，43.5%在采样时与母亲同住。值得注意的是，调查中仅有一位女儿报告为剖宫产出生。

**图1 大规模Isala队列中母女子集的阴道微生物组谱系**

(A) 研究队列概览，包含每对家庭成员（F）的年龄信息、同住状态和分娩方式。家庭按母亲（M）与成年女儿（D）之间平均微生物相似性排序。我们的队列包含23对母女，其中两位母亲各有不止一个女儿（在F04和F17家庭内），女儿按从长至幼排序。同住状态以不同线型表示，母亲和女儿的分娩方式以符号形状表示，包括阴道分娩（o）或剖宫产（Δ），优势种（相对丰度约30%或以上）以不同颜色表示。如果谱系不被这些四种物种中的任何一种所（共同）主导，则符号为灰色。

(B) 分析至物种水平的阴道宏基因组分类组成，按家庭分组，并根据母亲与成年女儿之间的平均微生物相似性排序。

(C) 真实母女对阴道微生物组谱系的观测Bray-Curtis相似性指数（蓝色点），观测平均值（蓝色线）与随机母女组合的Bray-Curtis相似性指数平均值（小提琴图；10,000次排列，平均值以蓝色线标示）相比，显示出明显显著差异（***p = 0.0008）。图形使用Adobe Illustrator组装。

随后，我们使用包含每个物种一个代表性基因组的数据库，确定了阴道宏基因组在物种水平的分类组成。在分析的23对母女中，有12对（F01–F05和F10–F13）的母亲和女儿宏基因组均以*L. crispatus*为优势种（定义为相对丰度约30%或以上的物种；表S1）。在三对母女（F06、F07和F08）中，*L. iners*同时是母亲和女儿的优势种。在其他常见的阴道微生物组乳杆菌中，*L. gasseri*主导了一个女儿（F16D）的微生物组，而*L. jensenii*在我们的家庭队列中任何样本中均未成为优势种。此外，六名母亲（F09M、F14M、F15M、F16M、F17M和F19M）和七名女儿（F06D、F07D、F09D、F15D、F16D、F17D2和F18D）的阴道宏基因组以非乳杆菌属（共同）主导，包括F09的宏基因组均以加德纳菌属（*Gardnerella* spp.）为优势（母亲中*G. leopoldii*的相对丰度为50.5%，女儿中*G. vaginalis*的相对丰度为39.7%）。

接下来，我们基于Bray-Curtis相似性指数进行排列检验，评估女儿的阴道微生物组谱系是否与亲生母亲的谱系比与队列中随机母亲的谱系更相似。我们仅将女儿的谱系与随机"母亲"的谱系进行比较，而非与队列中随机个体的谱系比较，以校正年龄和是否生育等协变量，因为这些因素在此前从Isala第一阶段（本研究样本采集阶段）的研究中已被发现与阴道微生物组组成显著相关。尽管真实母女对的相似性指数存在较大变异（标准差为37.9），但分析结果显示，真实母女对之间的相似性显著高于随机母女对（图1C，p = 0.0008）。女儿与其亲生母亲的阴道微生物组平均相似性为48.3%，与随机母亲的阴道微生物组相似性为31.8%。值得注意的是，真实对的最高相似性指数出现在母亲和女儿均以乳杆菌属为优势的谱系中。

鉴于母女对在物种水平上的显著相似性以及该队列中超过50%的母女对均以*L. crispatus*为优势种，我们利用广义线性混合模型研究了母亲和女儿阴道微生物组中*L. crispatus*优势状态之间的潜在关联。母亲阴道微生物组中*L. crispatus*的优势状态（相对丰度约30%或以上）确实与该物种在相应女儿阴道微生物组中的优势状态存在强烈关联。具体而言，母亲以*L. crispatus*为优势种的女儿，其自身以*L. crispatus*为优势种的几率显著高于母亲不以*L. crispatus*为优势种的女儿（比值比 = 21，p < 0.01）。总体而言，母体微生物组中*L. crispatus*的优势状态解释了女儿阴道微生物组中优势物种变异性的约41%（边际R2 = 0.41）。在该分析中，与家庭水平随机效应相关的方差可以忽略不计，表明母体优势状态捕获了家族内部依赖性的绝大部分。结果对模型设定是稳健的，因为使用不包含随机效应的逻辑回归模型获得了相似的效果大小。

总体而言，这些发现强调了成年母女在物种水平上阴道微生物组的相似性。为了调查在其他队列中是否也观察到母女之间类似的物种水平相似性，我们分析了来自一个非欧洲队列的47个已发表的阴道宏基因组数据，该队列包括22位母亲（32–51岁）和25位女儿（14–35岁）（表S2）。需要注意的是，这些参与者最初参加了一项阴道冲洗干预研究，这可能影响其阴道微生物组的组成。与我们的队列相比，该队列中更多参与者由非乳杆菌属物种主导（n = 14），或拥有更多样的阴道微生物组（n = 15；图S2A）。值得注意的是，47名参与者中有28人表现出细菌性阴道病症状（Nugent评分为5–10；表S2）。然而，采用与我们Isala数据集类似的物种水平方法，对该更多样的非欧洲队列进行置换分析也证实，真正母女对之间的相似性显著高于随机预期（图S2B，p < 0.0001）。

阴道细菌株系在母亲与成年女儿之间共享

为了确定所观察到的微生物组相似性是否不仅在物种水平上显著，还延伸到株系水平，我们使用inStrain将Isala母女对的高质量宏基因组映射到L. crispatus、L. iners、G. vaginalis和G. leopoldii（该队列中最常主导的阴道物种）的参考基因组。对于G. leopoldii参考基因组，该映射还纳入了Gardnerella swidsinskii的reads，因为这两个物种极为亲缘相近（平均核苷酸一致性（ANI）> 0.95）。在株系共享结果中，我们将这两个物种统一标记为G. leopoldii。对映射所得宏基因组的特征进行比较，得出各宏基因组之间的基于群体的平均核苷酸一致性（popANI）值。然后将这些值转换为基于popANI的每兆碱基单核苷酸变异数（popSPM）值，以获得更适合比较极为亲缘相近基因组的尺度。

我们进一步评估了来自同一家庭和不同家庭女性的popSPM值分布（图2）。基于这些分布，popSPM范围的低端极值仅对应于家庭内比较。随后，我们将L. crispatus、L. iners和G. vaginalis的共享株系定义为基因组距离不超过100 popSPM（popANI ≥ 99.99%）的基因组。在这里，我们假设共享株系由reads支持，这些reads映射到参考基因组的序列一致性至少为95%，并且在两个宏基因组中都覆盖至少50%的基因组（广度）。得益于这种方法，我们获得了适合研究目标的株系共享阈值：检测母亲与其成年女儿之间的阴道株系共享。应用这些阈值后，我们发现七对母女共享株系（表1；图3）。具体而言，在四个由L. crispatus主导的母女对（F01、F04M-F04D4、F10和F13）中观察到L. crispatus株系共享的情况。对于L. iners，在两对母女（F08和F14）中发现共享株系，除F14M外，所有对成员均由该物种主导。此外，该分析还揭示了一对母女（F09）中G. vaginalis株系共享的情况。对于G. leopoldii，一对母女的popSPM值（428.9 popSPM）低于该物种在家庭内（428.9–22,859.0）和家庭外（5,824.2–26,508.9）获得的所有其他popSPM值，表明这两个G. leopoldii株系之间的基因组相似性相对更高。然而，我们认为该值过高，无法有把握地将其归因于近期直接或间接的株系传播，因为它对应的ANI等于或低于99.99%（≥ 100 popSPM）。

图2 Isala参与者中同一家庭与不同家庭之间最常见主导阴道物种株系的基于宏基因组的成对距离

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（A–D）距离以基于popANI的每兆碱基单核苷酸变异数（popSPM）量化。对于Lactobacillus crispatus（A）、Lactobacillus iners（B）和Gardnerella vaginalis（C），设定了不超过100 popSPM的阈值（蓝色线）来识别株系共享事件。使用的缩写：popANI = 基于群体的平均核苷酸一致性。Gardnerella leopoldii的结果（D）可能还包含Gardnerella swidsinskii的popSPM值。图形使用RStudio（v.4.4.0）制作。

图3 全队列网络图，展示Isala母女队列中检测到的Lactobacillus crispatus、Lactobacillus iners和Gardnerella vaginalis的株系共享实例

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参与者以圆圈表示。圆圈根据四种（共同）主导物种着色，某一物种的主导定义为在阴道微生物组中相对丰度约为30%或以上。如果特征不由这四种物种之一（共同）主导，则符号为灰色。株系共享实例基于基于群体的平均核苷酸一致性（popANI）阈值，即每兆碱基100个单核苷酸变异数（popSPM）。检测到的株系共享实例通过参与者之间的非比例连接线表示，线条形状根据所使用的不同比较方法而定，线条颜色根据共享株系的物种而定。与母亲同住的女儿以"房屋"图标表示，唯一一位剖宫产出生的女儿以"菱形"符号表示。使用的缩写如下：F = 家庭，M = 母亲，D = 女儿。图形使用BioRender.com制作。

物种 | 家庭 | 母亲 | 女儿（年龄/岁） | 宏基因组之间的距离（popSPM）
Lactobacillus crispatus | F01 | F01M | F01D（18） | 4.0
Lactobacillus crispatus | F04 | F04M | F04D4（24） | 28.6
Lactobacillus crispatus | F10 | F10M | F10D（20） | 10.2
Lactobacillus crispatus | F13 | F13M | F13D（19） | 2.8
Lactobacillus iners | F08 | F08M | F08D（22） | 6.0
Lactobacillus iners | F14 | F14M | F14D（24） | 59.6
Gardnerella vaginalis | F09 | F09M | F09D（23） | 50.2

表1 Lactobacillus crispatus、Lactobacillus iners和Gardnerella vaginalis的株系共享实例概览

株系共享实例由inStrain使用基于popANI的每兆碱基100个单核苷酸变异数（popSPM）阈值确定。对于每个物种，使用Genome Taxonomy Database（GTDB）R226中对应的参考基因组构建inStrain特征。女儿年龄在括号中注明。若有多个女儿属于同一家庭，则女儿编号。使用的缩写如下：F = 家庭，M = 母亲，D = 女儿。

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为了调查非欧洲队列中同样四个物种的株系共享，并评估我们的发现能否在另一个队列中得到验证，我们将我们的株系水平方法应用于其阴道宏基因组。为保持一致性，我们使用了相同的株系共享截断值，即不超过100 popSPM。对于该数据集，家庭内和家庭间比较均在截断值以下检测到（图S3A–S3D）。总体而言，我们在L. crispatus、L. iners、G. vaginalis和G. leopoldii中发现十七例株系共享，其中六例在母女对之间，一例在姐妹之间（表S4；图S4）。值得注意的是，对于L. crispatus，所有三对共享株系的母女对（F01、F03和F05）均由该物种主导，而在共享L. iners株系的母女对（F21和F30）中，L. iners并非主导物种。对于G. vaginalis和G. leopoldii，分别在一对姐妹（F23D1-F23D2）和一对母女（F21）中检测到株系共享。与我们的Isala队列不同，在这个非欧洲女性队列中，除了母女之间的株系共享外，在100 popSPM的阈值下，还在不同家庭的参与者之间检测到株系共享实例（L. crispatus、L. iners和G. leopoldii，17例中有10例）。

目标培养L. crispatus揭示额外的母女株系共享

虽然应用于宏基因组数据的popANI指标和由此衍生的popSPM尺度能够捕获在给定测序深度下可检测到的多数（即最丰富）和/或少数（即较少丰富）株系的共享，但其他丰度更低的株系可能低于阈值而因此被遗漏。因此，为了探索这种低丰度株系的可能存在和共享，我们在Isala母女对上以目标培养方法补充了基于宏基因组的方法。这一分离策略专注于L. crispatus，因为L. iners和Gardnerella spp.由于特定的生长要求和应激敏感性（例如厌氧培养、添加血液和半胱氨酸）而无法可靠地培养，尤其是在Isala公民科学设置中，从家中采集并以室温运输到实验室的样本中更难以培养。来自由L. crispatus主导的家庭中，我们使用选择性酸化亚培养阶段成功从属于八个家庭的18名参与者中获得了75株L. crispatus分离菌株（每参与者1至9株，表2；表S5），从而模拟人体阴道生理学并限制其他竞争性菌群（例如也可以在MRS上培养的粪肠球菌和链球菌）的生长，这些菌群可能在室温运输期间增殖。

参与者 | 分离菌株（数量） | 代表性分离菌株（数量） | 降噪后与对应宏基因组的非参考依赖距离（popSPM） | 降噪后代表性分离菌株基因组间的非参考依赖距离（popSPM）
F03M | 4 | 2 | 849.6 | 1128.2 ± 7.50 | 0.5
F04D2 | 3 | 2 | 1.3 | 1918.9 ± 42.3 | 3.2
F04D3 | 2 | 2 | 0.92 | 18.9 ± 28.6 | 7.3
F01D | 1 | 1 | 11.6 | N/A
F02M | 4 | 1 | 3.2
F02D | 5 | 1 | 1.3
F03D | 6 | 1 | 5.3
F04M | 5 | 1 | 5.6
F04D1 | 3 | 1 | 6.3
F04D4 | 9 | 1 | 6
F10M | 5 | 1 | 7.3
F10D | 5 | 1 | 3.1
F11M | 4 | 1 | 5.4
F11D | 4 | 1 | 200.2
F12M | 4 | 1 | 0.9
F12D | 4 | 1 | 2.2
F13M | 4 | 1 | 1.4
F13D | 3 | 1 | 2.7

表2 针对Isala母女队列中Lactobacillus crispatus的目标培养方法概览。

获得了Isala母女队列中18名由L. crispatus主导的参与者的阴道样本的L. crispatus分离菌株。若有多个女儿属于同一家庭，则女儿编号。列出了每位参与者获得的分离菌株数量以及通过SCARAP（v.1.0.0）获得的代表性分离菌株数量。使用inStrain通过对应分离菌株组装体作为参考基因组对宏基因组reads进行特征分析来确定非参考依赖距离。降噪前的原始非参考依赖距离见表S5。使用的缩写如下：F = 家庭，M = 母亲，D = 女儿，popANI = 基于群体的平均核苷酸一致性，popSPM = 基于popANI的每兆碱基单核苷酸变异数，N/A = 不适用。

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为了确定分离菌株是不同的株系还是克隆，我们使用近期开发的工具SCARAP对每位参与者的基因组进行测序和去冗余，该工具基于约2,000个单拷贝核心基因（取决于所比较的分离菌株）进行快速可扩展的比较基因组学，使用99.99%的ANI阈值，并在计算ANI时排除逐基因异常值。最终从18名参与者中获得21个代表性分离菌株基因组（表2）。值得注意的是，基于培养，三名参与者（一位母亲和两位女儿：F03M、F04D2和F04D3）被发现至少有两种不同的L. crispatus共存株系，表明宿主内存在一定程度的株系多样性。为进一步调查这一点，我们将每个代表性分离菌株基因组与对应的宏基因组以及其他代表性分离菌株基因组进行比较（适用于F03M、F04D2和F04D3；表S5）。为此，我们首先使用来自Genome Taxonomy Database（GTDB）的L. crispatus参考基因组，通过inStrain确定popSPM值。然而，我们必须实施降噪程序，因为未经降噪时popSPM值比预期的要大，而同一株系的popSPM应该为（接近）零。作为降噪程序的一部分，在对应变体基因组与对应宏基因组reads映射时使用分离菌株基因组的组装体作为参考基因组，并移除重叠序列边界处的SNVs（具体为每个重叠序列的前五个和后五个核苷酸）。值得注意的是，重叠序列边界处的噪声是通过分离菌株基因组的自组装比较揭示的（表S6）。实施降噪程序后，只有两个分离菌株基因组（来自F03M和F11D）未在对应的宏基因组中检测到，这表明通过目标培养可能富集了少数株系（表2）。

随后，我们纳入所有代表性分离菌株基因组进入inStrain分析，以补充我们基于宏基因组的L. crispatus株系共享方法。我们确认了先前仅基于宏基因组检测到的四对母女（F01、F04M-F04D4、F10和F13）的株系共享（表1和表3；表S7），并在F03和F11中识别出额外的株系共享，所有母亲和女儿均由L. crispatus主导。因此，我们共发现十二对由L. crispatus主导的母女中有六对（50%）可检测到共享L. crispatus株系（图3；表S8）。

家庭（女儿年龄） | 宏基因组或分离菌株基因组1 | 宏基因组或分离菌株基因组2 | popSPM | 参考依赖距离 | 降噪后非参考依赖距离
F01（23） | F01M | F01D（分离菌株） | 21.5 | 21.9
F03（31） | F03M（分离菌株1） | F03D | 23.3 | 10.5
| F03M（分离菌株1） | F03D（分离菌株） | 5.2 | 2.9
F04（24） | F04M | F04D4（分离菌株） | 91.1 | 143.1
| F04M（分离菌株） | F04D4 | 30.1 | 54.3
| F04M（分离菌株） | F04D4（分离菌株） | 68.7 | 79.5, 81.5
F10（20） | F10M | F10D（分离菌株） | 36.3 | 30.2
F11（20） | F11M（分离菌株） | F11D | 52.1 | 29.9
F13（19） | F13M | F13D（分离菌株） | 23.5 | 7.7
| F13M（分离菌株） | F13D | 14.8 | 2.7
| F13M（分离菌株） | F13D（分离菌株） | 29.7 | 43.6, 46.3

表3 基于我们结合宏基因组和分离菌株基因组的综合方法，具有Lactobacillus crispatus株系共享的母女对

株系共享实例基于基于popANI的每兆碱基100个单核苷酸变异数（popSPM）阈值。

距离测定使用inStrain工具完成，其配置文件基于来自基因组分类数据库（GTDB）R226的L. crispatus参考基因组构建（即参考依赖性距离），或基于经过去噪处理的对应分离株基因组组装结果（即去噪后的非参考依赖性距离）。原始非参考依赖性距离数据见附表S7。女儿的年龄以括号形式标注。若同一家庭有多名女儿，则进行编号区分。使用的缩写如下：F = 家庭，M = 母亲，D = 女儿。在新标签页中打开表格。基于StrainPhlAn 4工具，我们随后调查了在本队列中发现的共享和未共享的L. crispatus菌株之间的系统发育关系。该工具基于每个宏基因组中最丰度（多数）的L. crispatus菌株进行系统发育推断，所用标记基因为至少50%样本中存在的100个或以上的标记基因。具体而言，基于从27个宏基因组中检索到的L. crispatusreads以及来自表现出宿主内多样性的参与者的7个代表性分离株基因组，构建了系统发育树（图4；附图S5）。总体而言，基于宏基因组检测到的4例L. crispatus菌株共享事件仅涉及成对比较样本中L. crispatus群体内的多数菌株。对于其中一个家庭（F03），女儿的多数菌株与母亲中低于宏基因组检测阈值的菌株共享。在F11家庭中，共享菌株在两个样本中均为少数菌株。此外，为探索共享的L. crispatus菌株是否属于特定进化支或散布于系统发育树各处，我们纳入了100个来自不同来源的公开L. crispatus基因组（包括来自GTDB的参考基因组，见附表S9），以及从其他Isala健康志愿者中随机选取的20个阴道L. crispatus基因组（附表S10）。我们确认，构成家庭内共享菌株的基因组对散布于包含泌尿生殖道菌株（即人阴道、尿液和外宫颈黏膜）的进化支中，表明转移能力并不局限于特定谱系。此外，在本队列中检测到的来自同一宿主的共存菌株呈多源起源（分布于不同的亚进化支），进一步证实它们并非克隆变异体，从而印证了在这4名参与者中观察到的宿主内菌株多样性。图4 来自Isala队列母亲和成年女儿以及公开可获取基因组的L. crispatus菌株系统发育树——显示完整图注——图片查看器：系统发育树使用StrainPhlAn 4工具构建，基于从27个宏基因组中检索到的L. crispatusreads以及来自F03M、F04D2、F04D3和F11D（F03M、F04D2、F04D3各两名参与者各两个分离株，F11D一个）的7个代表性分离株基因组，这些参与者表现出宿主内菌株多样性。此外，还纳入了100个来自不同来源的随机高质量L. crispatus基因组（包括分离株基因组和宏基因组组装基因组），来源于基因组分类数据库（GTDB）R226，以及本队列之外Isala健康志愿者的20个分离株基因组。StrainPhlAn 4基于物种特异性标记基因的多序列比对生成系统发育树，并使用RStudio中phytools包的midpoint.root函数进行中点根定。需要注意的是，StrainPhlAn报告的是给定宏基因组样本中多数菌株对应的共识菌株配置文件。Isala菌株以菱形末端表示。样本来源以彩色末端标签指示。粉色标签表示在本队列母亲与女儿之间检测到的菌株共享事件，检测基于基于群体平均核苷酸一致性（popANI）的标准——即每百万碱基对（popSPM）中100个SNV。来自同一参与者的多个代表性分离株以括号内的编号标签表示。共存菌株（或来自同一宿主的菌株）以不同的符号形状表示。扩展标注版见附图S5。母女间L. crispatus菌株共享发生在阴道分娩和当前共同居住之外为探讨哪些生活方式、生命历程或其他元数据可能影响菌株共享水平，我们分析了6对在检测出共享菌株的L. crispatus优势型母女配对中于采样时收集的问卷元数据。其中三对中的母亲（F03M、F04M和F13M）在采样时自报已绝经（46–68岁），表明共享菌株可以跨越这一伴随重要生理变化和L. crispatus丰度普遍下降的重要生命阶段而持续存在。总体而言，6名与母亲共享菌株的女儿年龄在19至31岁之间。对于这些母女配对，我们通过评估女儿年龄与宏基因组对分离株基因组比较所得的去噪非参考依赖性popSPM值之间的关系，来调查这种共享是否可能源于出生时的菌株传递（附图S6）。未观察到相关性，提示检测到的共享可能不能完全归因于出生时的菌株获取，或者这些配对中L. crispatus菌株获得SNV的速率存在显著差异。目前对L. crispatus在厌氧条件下SNV积累速率的最佳估计约为每年8个SNV。对于F13和F03家庭，观察到的SNV计数特别低（分别约为全基因组范围的10和21个）。这表明这些家庭L. crispatus谱系的共同祖先最多可追溯到几年前，很可能并非出生时。关于分娩方式，我们观察到通过剖宫产出生的F10D（图1A）基于宏基因组和分离株基因组与母亲共享L. crispatus菌株。尽管这是本队列中唯一一例，但这一发现表明阴道分娩并非L. crispatus菌株共享的严格前提条件。此外，基于采样时报告的居住情况，我们探讨了当前共同居住（图1A）是否为L. crispatus菌株共享的必要条件。6对检测出共享菌株的母女配对中有4对在采样时仍共同居住，而2名女儿（F03D和F04D4）已搬离，分别与其伴侣共同居住超过1年和超过3个月。这表明在没有当前或近期共同居住的情况下也可以观察到L. crispatus菌株共享。有趣的是，在F04家庭中，4名女儿中仅有1名（F04D4）可检测到与母亲共享L. crispatus菌株，尽管在样本采集前3个月内曾使用过抗菌药物（即局部使用Gyno-Daktarin和口服氟康唑）。综上所述，我们的发现表明母亲与女儿之间的L. crispatus菌株共享可能反映了传递和长期持续存在。阴道分娩和共同居住环境可能促进传递，但似乎并非严格必要条件，这指向了对阴道微生物组持续存在的更广泛理解，即特定物种和菌株在不同个体和生命阶段之间的持续存在。讨论尽管对宿主关联微生物群落的兴趣日益增长，但关于决定阴道微生物组建立和动态的因素仍存在关键知识空白。在我们Isala项目的第一批佛兰德队列中，我们已经能够识别出解释参与者间阴道微生物组变异的部分生物学和生活方式因素。在这项后续工作中，我们在物种和菌株水平上研究了参与Isala项目的成年母亲和女儿的宏基因组和分离株基因组，以调查遗传亲缘关系和/或共享环境对阴道微生物组的贡献。值得注意的是，这些参与者可以自由沟通参与的家庭成员。基于宏基因组，我们发现真正母女配对内存在显著的物种水平相似性以及不同产乳酸细菌（L. crispatus、L. iners和G. vaginalis）的共享菌株。有趣的是，纳入L. crispatus分离株基因组使我们能够确认该物种检测到的菌株共享事件，并识别出更多事件，均出现在母女配对中。我们观察到共享菌株的popSPM值与女儿年龄之间无可检测的相关性，特别是两例共享事件的popSPM值特别低，这表明传递可能不仅仅发生在出生时，也可能在生命后期发生，并且可能是双向的。值得注意的是，关于共享环境，最低的两个popSPM值分别出现在采样时不共同居住和共同居住的母女配对中。关于共享菌株的其他潜在来源，来自其他遗传和/或社会关联个体的细菌对阴道微生物组塑造的贡献仍不清楚，尽管在社会关联个体的肠道微生物组等其他生态位中已有相关研究。值得注意的是，最近的研究表明男性伴侣是加德纳菌属等可能通过伴侣间传递导致细菌性阴道炎复发的类群的重要来源。在本队列中，我们仅在一对母女配对中发现G. vaginalis菌株共享的证据，但这种低检出率可能与我们分析的配对中该物种的低流行率有关。超越母女配对调查G. vaginalis或其他阴道类群的传递（包括伴侣间传递），需要专门的设置，包括遗传和社会网络，最好在不同世界队列中进行。与阴道微生物组研究不同，关于母亲与新生儿、共同居住者及同一村庄人群肠道、皮肤和口腔微生物组菌株共享的研究更为常见，正如Heidrich等人最近综述的那样。迄今为止规模最大的这些生态位人类微生物组传递研究之一（最多9,712个宏基因组），包括纵向采样设置并使用物种依赖性菌株共享阈值，显示共同居住时间比遗传亲缘关系影响更大。然而，这一发现可能由在这些更开放的微生物栖息地中观察到的频繁细菌转运所致，与阴道相比。迄今为止，已有多种菌株水平分析工具可用，其中inStrain最为常用，因为它考虑了单个样本中共存菌株的存在。使用该工具，我们揭示了L. crispatus的某些宿主内菌株多样性，这在迄今为止研究不足，尤其是其对宿主和微生物群落的生物学和生态学意义。然而，在本队列中观察到的宿主内菌株多样性有限，基于宏基因组和分离株基因组的整合分析，每个个体最多检测到两个不同的L. crispatus菌株。这是否是一个真正的生物学发现（即大多数个体同一物种不超过两个不同菌株）仍有待调查，因为我们的结果可能受到方法因素的影响，包括微生物组检测和培养中使用不同的拭子、酸化子培养方法以及菌落挑取偏差，这些可能降低低丰度菌株的检测或选择。在这方面，从阴道微生物组中恢复更多共存菌株将能够评估其独特特征及其在塑造群落动态中的潜在作用，而这些在仅依赖深度宏基因组测序数据时仍然未知。在使用inStrain进行菌株水平调查时，我们还发现参考基因组的选取和菌株共享阈值的建立都是关键步骤。我们选择了GTDB来源的L. crispatus参考基因组（ATCC 33820，组装编号：GCA_018987235.1），以提供该物种内菌株比较的标准化共识框架。此外，我们选择了严格的标准——最多100个popSPM——来定义成年母女配对中的共享菌株。这种基于popANI的标度化方法允许在菌株水平分析中遇到的高度相似水平下提供更好的可解释性。此前，在一项非欧洲队列中，也有研究者使用基于宏基因组的inStrain调查了母亲与青少年/成年女儿之间阴道微生物组的相似性。在他们的研究中，未发现真正母女配对在物种水平相似性或菌株共享事件上相较于无关个体表现出更多相似性。在物种水平，我们观察到这些母亲和女儿的阴道微生物组之间存在显著相似性。这种发现差异可能源于用于将真正配对相似性指数与置换配对平均值进行比较的方法差异。在菌株水平，作者使用的阈值相当于1,000个popSPM，而我们使用了更严格的100个popSPM标准。此外，他们将reads比对到MAGs，而我们使用的是参考基因组或分离株基因组组装结果。

当我们将工作流程应用于四种感兴趣的物种时，我们确实在非欧洲队列中检测到家庭内部共享菌株实例的数量较少（17个检测到的实例中有7个），低于家庭外部的数量。这与在Isala队列中观察到的情况相反，在该队列中我们仅在母女配对中检测到共享菌株实例（n = 9）。这种差异可能与阴道微生物组组成的差异有关，可能受宿主因素、文化习惯或环境因素的影响。例如，在西方人群的阴道微生物组中经常报道的L. crispatus优势物种，在Isala队列中更为普遍（即Isala队列中23对中的12对 vs. 非欧洲队列中25对中的3对）。从技术角度来看，已证明共享菌株分析对即使是低水平的污染也极其敏感，这最近导致开发了追踪污染事件的工具（例如CroCoDeEL），我们建议如果这些工具适用于阴道微生物组调查，应结合实验室笔记（如可获取）进行补充。虽然对于我们的队列这些数据是可获取的，但在公开可访问的数据集中（包括非欧洲队列）这类数据经常缺失，这代表了二次分析的常见局限性。因此，对于Isala队列，我们严格控制了潜在的交叉污染，并根据我们的严格质量控制标准移除了任何显示潜在交叉污染迹象的样本，包括将宏基因组数据与相应的16S rRNA扩增子测序数据进行比较。总之，我们的发现代表了朝着理解阴道微生物组的建立和动态及其在物种水平和菌株水平上潜在决定因素迈出的重要一步。关键的是，我们的综合方法，结合了深度宏基因组测序与目标培养方法、严格的菌株水平阈值、严格的质量控制措施以及基于基因异常值排除的稳健去噪程序，使我们能够高分辨率地检测到母女配对中的共享菌株，并揭示宿主体内的菌株多样性。这些定制化的方法不仅增强了我们发现的可靠性，还为其他生态位和临床环境提供了可适应的框架，例如基于微生物组的干预（如施用活生物治疗产品）或微生物组移植研究（如粪便和阴道），使用定制阈值调查所施用/转移菌株的定植情况。在这方面，我们展示了阴道微生物组，尽管通常由单一物种主导，但在有利的生理条件下可以作为接收性环境，从而为基于乳杆菌的应用开辟了新视角。基于青少年和成年女儿及其相应母亲的样本，我们证明了她们阴道微生物组中存在相当程度的物种和菌株共享，这可以受遗传或环境因素和/或代际间菌株传递的影响。

**研究局限性**

尽管我们获得了有价值的共享菌株发现并精心选择了方法，我们的研究也存在一些局限性。我们的研究人群来源的Isala队列最初是为了绘制自我报告的健康女性以及参与者的阴道微生物组组成，而与其母亲一同参与的参与者构成了相对较小的亚队列。问卷中缺少某些与生活习惯相关的变量（例如共用洗衣机、厕所和毛巾），这导致未能发现共享同一环境的遗传和社会相关个体之间潜在的传播途径。总体而言，阴道微生物菌株的潜在储库、传播途径和动力学应通过纵向研究加以阐明，这些研究应辅以广泛的生活方式数据收集和更大规模的母亲-女儿队列中宿主遗传数据的分析，同时也应包括女性合租者和其他非遗传相关参与者。理想情况下，这些研究应从女儿出生开始直到其生育年龄以及母亲的绝经后阶段，使用适当的采样设备并采集不同身体部位的样本，同时结合经过验证的激素和pH测量值，使这些研究具有高度的密集性。这将允许进行专注于不同生命阶段和身体生态位中基因水平和功能性变化的菌株水平分析，这些生态位可能是细菌的储库，进一步定植阴道生态位（例如皮肤）。

**资源可用性**

**主要联系人**

有关研究中使用的资源的额外信息请求应发送并履行给主要联系人Sarah Lebeer（[e-mail]）。

**材料可用性**

商业上不可获得的Isala菌株在合理请求下并通过与安特卫普大学签署的材料转让协议后可从主要联系人处获得。

**数据和代码可用性**

- 所有原始代码已存于GitHub并公开可用，位于GitHub（www.github.com/LebeerLab/isala_pairs）和Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.21705357），自出版日期起。
- 用于验证和质量控制的16S rRNA扩增子测序数据以及宏基因组读段可在欧洲核苷酸档案中获取，分别位于生物项目PRJEB50407和PRJEB87999下。
- 分离株基因组可在欧洲核苷酸档案中获取，位于生物项目PRJEB105013下。
- 16S rRNA测序和宏基因组测序数据集的ENA登录标识符见附表S11，分离株基因组的登录标识符见附表S12。
- 重新分析本研究报告数据所需的任何其他信息均可向主要联系人请求。

**致谢**

我们首先感谢所有参与我们研究的Isala志愿者以及应用微生物学与生物技术实验室中在Isala采样活动和处理过程中发挥了重要作用的所有同事和学生，并在数据驱动的头脑风暴会议中提供了支持，特别感谢Brayan E. Gonzales在统计分析中的支持。战略支持也来自Biobank Antwerpen（安特卫普大学医院）。作者感谢以下资助机构：弗拉芒研究基金会（FWO；M.P.-B.的博士基本研究资助1181726N，M.H.的博士战略基础研究资助1S89826N，以及S.W.和I.D.B.各自的博士后研究资助12AZ624N和12S4222N），以及安特卫普大学特别研究基金（UA BOF；S.A.的DOCPRO 37054资助）。Lebeer教授实验室感谢以下对阴道微生物组研究的资助：FWO SBO项目DeVEnIR（S006424N），FWO研究项目G049022N和G031222N，FWO ERC Runner-up项目ELLA G0ATZ25N；弗拉芒大学间特别研究基金（iBOF）对POSSIBL项目的资助；工业研究基金（IOF）UAntwerpen对IOF POC项目CRUCIAL的资助；BOF对Isala的资助；以及欧洲研究委员会（ERC）对启动资助Lacto-Be（H2020）（资助ID 852600）和概念验证VALERIE（Horizon）（资助ID 101213306）。N.S.由ERC Consolidator Grant microTOUCH（资助ID 101045015）支持。

**作者贡献**

概念化：S.L., S.W., C.N.A., T.G., S.A., 和V.V.；方法：M.P.-B., I.E., S.W., 和S.L.；调查：M.P.-B., I.E., C.N.A., M.H., T.E., T.G., S.A., J.D., I.D.B., M.H., V.V., S.V.P., 和N.S.；数据管理：M.P.-B., I.E., T.E., T.G., 和S.W.；软件：M.P.-B., T.V.R., T.G., N.S., 和S.W.；可视化：M.P.-B., I.E., 和M.H.；正式分析和解释：M.P.-B., I.E., T.E., T.G., S.A., C.N.A., S.W., 和S.L.；初稿撰写：M.P.-B., I.E., C.N.A., S.W., 和S.L.；资金获取：S.L.；资源：I.D.B.；监督：S.L., S.W., 和C.N.A.。所有作者审阅、编辑、校对并批准了最终手稿。

**利益声明**

S.L.声明为国际益生菌和益生元科学协会（ISAPP, www.isappscience.org）的志愿学术董事会成员，YUN和aMylla的联合创始人，以及Freya Biosciences的科学顾问。S.L.的团队声明从YUN、BioOrg、Puratos、DSM-Firmenich、DSM I-Health、Drylocks、Lesaffre/Gnosis、Fonterra和Copan获得研究资助或研究消耗品。S.V.P.声明与GSK-GVGH合作。N.S.也是Freya Biosciences的科学顾问。这些组织或公司均未参与本研究的设计或数据分析，该研究完全由大学、政府和欧洲资金资助。T.E.部分资金来自与本工作无关的VLAIO工业研究资助。S.A.声明为ISAPP学生和博士后协会的志愿成员。

**方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **生物样本** | | |
| 阴道样本 | Isala项目，安特卫普大学 | ClinicalTrials.gov: NCT04319536 |
| **化学品、肽和重组蛋白** | | |
| 氨苄青霉素 | Carl Roth | 货号 K029.1 |
| 氯化钠（NaCl） | Merck | 货号 1064045000 |
| 二水合乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O） | Merck | 货号 1084540100 |
| 溶菌酶 | Merck | 货号 L6876-5G |
| RNase | Merck | 货号 R6513-50M |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Merck | 货号 62862-1KG |
| 蛋白酶K | Macherey-Nagel | 货号 740506 |
| 乙酸钾 | Merck | 货号 95843-100M |
| L-FG | — | — |
| 冰醋酸 | VWR International | 货号 20104.312 |
| 异丙醇 | Merck | 货号 109827-1L |
| 乙醇 | Acros Organics | 货号 BP2818-4D |
| 无DNase/RNase蒸馏水 | Fisher Scientific | 货号 11538646 |
| 甘油 | Carl Roth | 货号 3783.1 |
| Difco?乳杆菌MRS肉汤 | Fisher Scientific | 货号 288130 |
| Difco?乳杆菌MRS琼脂 | Fisher Scientific | 货号 288210 |
| L-半胱氨酸 | Roth | 货号 3467.1 |
| 氯化钾（KCl） | AnalytiChem Belgium | 货号 CL00.1133.1000 |
| 磷酸氢二钠（Na2HPO4） | Merck | 货号 S0876-500 |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Fisher | 货号 10781521 |
| 氢氧化钠（NaOH） | VWR | 货号 28245.367 |

**关键商业检测**

| 检测名称 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| DNeasy PowerSoil Pro试剂盒 | Qiagen | 47016 |
| Illumina DNA Prep Tagmentation试剂盒 | Illumina | https://www.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/illumina-dna-prep.html |
| NovaSeq 6000 DX S4试剂试剂盒v1.5 | Illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/cluster-gen-sequencing-reagents/novaseq-reagent-kits.html |

**已存入数据**

| 数据集 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 16S rRNA扩增子测序数据 | Lebeer等，欧洲核苷酸档案 | PRJEB50407 |
| 宏基因组读段 | 欧洲核苷酸档案 | PRJEB87999 |
| 分离株基因组 | 欧洲核苷酸档案 | PRJEB105013 |
| 非欧洲队列的宏基因组读段 | France等 | PRJNA779415 |

**物种和菌株水平分析工作流程**

| 工作流程 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| 物种和菌株水平分析工作流程 | 本文 | www.github.com/mariapinedob/isala_pairs |

**寡核苷酸**

| 引物 | 序列 | 来源 |
|---|---|---|
| 27F和1492R通用16S引物 | 27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和 1492R (5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′) | 本文 |
| 标识符 | N/A | — |

**软件和算法**

| 软件 | 版本 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|---|
| Fastp | 0.23.2 | Chen | https://github.com/OpenGene/fastp |
| Hostile | 1.1.0 | Constantinides等 | https://github.com/bede/hostile |
| MultiQC | 1.13 | Ewels等 | https://github.com/MultiQC/MultiQC |
| Sylph | 0.8.02 | Shaw和Yu | https://github.com/bluenote-1577/sylph |
| GlobalDB | 226 | Speth等 | https://globdb.org/home |
| R | 4.4.0 | 在线 | https://cran.r-project.org/bin/windows/base/old/ |
| Tidytacos | 1.0.1 | Wittouck等 | https://github.com/LebeerLab/tidytacos |
| Genome Taxonomy Database | R226 | Parks等 | https://gtdb.ecogenomic.org/ |
| Shovill | 1.1.0 | Seemann | https://github.com/tseemann/shovill |
| CheckM2 | 1.1.0 | Chklovski等 | https://github.com/chklovski/CheckM2 |
| GUNC | 1.0.13 | Orakov等 | https://github.com/grp-bork/gunc |
| SCARAP | 1.0.0 | Wittouck等 | https://github.com/SWittouck/SCARAP |
| inStrain | 1.8.0 | Olm等 | https://github.com/MrOlm/inStrain |
| MetaPhlAn | 4.1.1 | Blanco-Miguez等 | https://github.com/biobakery/metaphlan |
| StrainPhlAn | 4 | Truong等 | https://github.com/biobakery/metaphlan |

**实验模型和研究参与者细节**

**研究设计和样本采集**

本研究中使用的阴道样本来自在比利时Isala公民科学项目第一阶段注册的参与者。Isala项目经安特卫普大学医院/安特卫普大学伦理委员会批准（B300201942076），符合《赫尔辛基宣言》的规定，所有参与者在纳入前均提供了书面知情同意书。总体而言，Isala第一阶段包括3,350名18岁或以上健康非怀孕女性，她们填写了包含生活习惯相关因素的问卷，并捐赠了两份自我采集的阴道样本：一份eNAT拭子（Copan, Brescia, Italy）用于微生物组分析，一份eSwab拭子（Copan, Brescia, Italy）用于分离目的。自我采集后，阴道拭子由参与者冷藏保存（4°C），并通过预付费国家邮政服务以环境温度运输。到达后，eNAT拭子立即在?20°C储存直至处理，而eSwab拭子在4°C储存。在最长6小时的储存时间后，eSwab拭子在涡旋振荡器中振荡约15秒，然后将500 μL样品悬浮液与500 μL 50%甘油在96孔Micronic板中混合，并在?80°C储存以供分离。

在Isala参与者中，35名女性被识别为与其母亲一同参与。具体而言，我们的队列（n = 62）包括25位母亲（M），每位母亲有一名参与的女儿（D）（包括祖母-女儿-孙女三代组合），以及3位母亲分别有2名、4名和4名女儿参与，共计35对母女配对。该队列的相关人口学特征（即年龄和共同居住状态）在结果部分中描述，并在图1A中展示。

**从阴道样本中分离和培养L. crispatus**

L. crispatus分离株通过培养来自宏基因组均被该物种主导的母女配对自我采集的eSwab样本来获取。采用了一种选择性分纯阶段，使用内部协议将分离过程向阴道乳杆菌进行定制。为此，对于每个储存的eSwab，刮取少量拭子材料并接种到酸化至pH 4.6的10 mL MRS肉汤中，并补充0.3% L-半胱氨酸（Roth）作为额外的生长因子。在37°C、5% CO2条件下培养72小时后，将培养的eSwab在磷酸盐缓冲液（PBS, 1X）中进行10倍系列稀释，取50 μL涂布于标准MRS琼脂、补充0.3% L-半胱氨酸（Roth）的MRS琼脂或酸化至pH 4.6的MRS琼脂平板上。培养皿直接在37°C、5% CO2条件下培养或在含有厌氧气体发生包（AnaeroGen 2.5 L, Thermo Scientific）的厌氧罐中培养。培养后，根据目视检查和16S rRNA基因菌落PCR选择菌落，并通过凝胶电泳检查。随后使用通用27F和1492R引物对PCR产物进行Sanger测序以进行物种水平鉴定。获取的数据进行处理，并使用内部管道（https://github.com/LebeerLab/nf-sanger）确定物种身份。

**方法细节**

**DNA提取和16S rRNA扩增子测序**

使用DNeasy Powersoil Pro试剂盒（Qiagen）从eNAT拭子（Copan）中提取DNA，作为Isala项目第一阶段的一部分，遵循先前优化的内部协议，并存放在安特卫普生物样本库（比利时安特卫普；ID: BE 71030031000）。

DNA提取物储存于-20°C，并按先前所述方法进行16S rRNA测序。

阴道样本的宏基因组测序

对纳入本研究队列的62名参与者提取的DNA进行深度宏基因组测序。文库制备和宏基因组测序均外包给Prebiomics公司（意大利特伦托），该公司使用Illumina平台，按照制造商的议程序述进行双索引、双端测序。简要来说，使用Illumina DNA Prep Tagmentation试剂盒（Illumina）和NovaSeq 6000 DX S4 Reagent Kit v1.5，每个样本可生成高达1.5亿条reads（45 Gb）。

原始宏基因组测序数据的处理与质量控制

使用fastp版本0.23.2的默认设置对原始宏基因组reads进行修剪和质量过滤（https://nf-co.re/mag/4.0.0/parameters/#quality-control-for-short-reads-options），随后使用Hostile版本1.1.0过滤掉人类reads。之后，使用MultiQC版本1.13评估质量。使用Sylph版本0.8.02和GlobDB进行分类学分配。

宏基因组与16S rRNA微生物组谱的对比

由于DNA提取物之前已进行16S rRNA扩增子测序，我们的质量控制包括两个步骤。首先，排除在16S rRNA扩增子测序中鉴定为低质量的样本，使其不纳入后续分析。然后，我们比较了16S rRNA扩增子测序和宏基因组测序产生的谱，并评估了（亚）属水平的分类组成相似性。去除两种技术之间对应较差的样本。随后，排除singleton样本，即缺少相应高质量女儿样本的母亲样本，或反之亦然。

物种水平微生物组谱分析

使用RStudio版本4.4.0和内部开发的包tidytacos版本1.0.1，以物种水平可视化每个宏基因组的分类组成。优势物种定义为相对丰度水平约30%或以上。使用置换检验确定真实母女样本之间的相似性是否超过基于Bray-Curtis相似指数（1减去Bray-Curtis不相似指数）的预期随机机会水平。具体而言，将每位女儿随机分配给队列中的某位母亲，并计算Bray-Curtis相似指数。此过程对每位女儿重复10,000次，然后计算这些置换的平均相似指数并与真实配对的平均相似指数进行比较。

乳杆菌优势模式的母女一致性

为评估母亲L. crispatus优势是否与女儿L. crispatus优势相关，拟合了具有二项误差分布和logit链接的广义线性混合模型（GLMM）。以女儿优势状态（二元：由L. crispatus优势或否）作为响应变量，母亲优势状态作为固定效应，家庭标识符作为随机截距，以考虑同一家庭中女儿之间潜在的非独立性。使用RStudio中的lme4包版本2.0拟合模型。通过对模型系数取指数获得优势比，使用Nakagawa和Schielzeth提出的边际R2评估模型解释力，如performance包版本0.16.0中实现的那样。作为敏感性分析，还拟合了一个不含随机效应的等价逻辑回归模型。

L. crispatus分离株的全基因组测序

在进行全基因组测序（WGS）之前，将L. crispatus分离株以五角形法划线接种于MRS琼脂上，以检查纯培养物，并在37°C、5% CO?下过夜培养。培养后，从每个琼脂平板上取单个菌落接种于10 mL MRS肉汤中，在37°C、5% CO?下过夜培养。培养后，按照内部方案提取每个分离株的基因组DNA。DNA提取物送至BGI（香港），使用DNB-seq平台进行测序。具体而言，在DNBSEQ-G400系统上进行测序，双端reads长度为150 bp。数据处理、组装、质量控制和基因组注释使用内部Nextflow流程进行（https://github.com/LebeerLab/nf-whole-genome-illumina）。简要来说，使用fastp版本0.23.2（默认设置）过滤原始双端reads，使用shovill版本1.1.0进行基因组组装（https://github.com/tseemann/shovill）。使用CheckM2版本1.1.0和GUNC版本1.0.13评估组装基因组的完整性与污染水平。完整性至少为98%且污染低于5%的基因组被纳入分析。为确保基因组表征的唯一性，使用内部开发的工具SCARAP版本1.0.0的sample模块对每位参与者的分离株基因组进行去冗余，ANI阈值为99.99%，在计算ANI时排除逐基因离群值（--method mean90设置）。

使用参考依赖方法鉴定共享菌株

使用inStrain版本1.8.0将宏基因组映射到目标物种的参考基因组，该工具根据给定的参考基因组计算两个样本之间的成对群体平均核苷酸一致性（popANI）值。为目标物种构建了一个包含基因组分类数据库（GTDB）中参考基因组的精选数据库。inStrain计算的popANI指标代表了在给定物种下，两个宏基因组中最密切相关的菌株（多数株或少数株）之间的相似性。对于inStrain profile，设置reads级别的最小ANI为95%。然后，使用inStrain的compare模块并执行--database_mode选项，该选项根据覆盖广度确定每个样本中的基因组存在性，并将比较限制在共享基因组，确保只比较在样本间可靠检测到的基因组。为了获得更适合检测极密切相关基因组的尺度，通过将popANI减1再乘以10?，将得到的popANI值转换为基于popANI的单核苷酸变异（SNV）每百万碱基（popSPM）。通过比较同一家庭中女性基因组之间与不同家庭中基因组之间的popSPM值分布来为每个物种建立菌株共享的定义阈值，同时考虑阴道生态位特征、该生态系统中存在的分类群以及参与者均为成年人的事实。当分离株基因组被纳入菌株共享分析时，应用相同的inStrain参数和阈值。

宿主内菌株多样性与家庭内菌株共享检测的参考非依赖程序

将分离株基因组的组装结果作为参考基因组，使用inStrain profile将其映射到对应的宏基因组reads（宿主内）以及相关宏基因组或分离株基因组（家庭内），--min_reads_ani阈值设为95%。作为我们对reads-to-genome比较方法的对照，将分离株基因组的WGS reads映射到其自身组装结果。这经常导致在contig边缘而非预期中无SNV的位置识别出"SNV"。因此，所有参考非依赖的reads-to-genome比较均通过移除距contig边缘五个或更少碱基处识别的SNV进行去噪。使用基于先前定义阈值的去噪popSPM值确定宿主内菌株多样性和家庭内菌株共享的实例。还评估了去噪popSPM值与女儿年龄之间的相关性。

非欧洲队列母女宏基因组测序数据的分析

从NCBI序列读码存档（Bioproject PRJNA779415）检索France等人发表的宏基因组测序数据。原始宏基因组reads按上述方法处理（参见"原始宏基因组测序数据的处理与质量控制"）。按照"物种水平微生物组谱分析"中的方法可视化分类谱，并按照"使用参考依赖方法鉴定共享菌株"中描述的方法鉴定菌株共享实例。纳入该非欧洲队列的参与者的相关人口学和临床特征汇总于附表S2。

L. crispatus的系统发育重建

使用StrainPhlAn版本4.1.0构建了整合宏基因组和分离株基因组的L. crispatus系统发育树。StrainPhlAn利用MetaPhlAn标记基因，推断一组宏基因组中给定物种每个样本中最优势菌株的系统发育。在我们的分析中，同时纳入了宏基因组reads和L. crispatus分离株基因组的reads。参数设置为包含至少在50%样本中存在的标记基因（--marker_in_n_samples_perc 50），并要求过滤后每个样本至少有100个物种依赖的标记基因（--sample_with_n_markers_after_filt 100）。在此分析中，使用SCARAP版本1.0.0从GTDB R226中公开可用的100个高质量L. crispatus基因组（包括分离株基因组和MAGs），来源于不同的来源，以及来自我们子队列外的20个健康Isala志愿者的分离株基因组中随机选择了参考基因组，并纳入StrainPhlAn 4工作流程。具体而言，至少纳入50%来自女性泌尿生殖道的基因组。所得系统发育树在RStudio版本4.4.0中处理和注释，并使用ggtree包结合GTDB中每个物种的参考基因组进行可视化。使用phytools包的midpoint.root函数进行中点根化。

定量与统计分析

统计分析

统计分析在RStudio版本4.4.0中进行。所有统计检验和样本量（n）的详细信息在相应的"方法细节"部分、结果及图注中提供。除非另有说明，统计显著性定义为p值<0.05。

软件

分析中使用的R包包括tidytacos、lme4、performance、ggtree和phytools。

补充资源

本研究中分析的阴道样本和细菌分离株通过Isala研究获得（ClinicalTrials.gov标识符：NCT04319536）。

补充信息（2）
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文件S1. 图S1-S6和表S1-S12
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文件S2. 文章及补充信息