腹腔内铜-锰纳米酶通过抗肿瘤免疫激活抑制腹膜转移

《BIOMATERIALS RESEARCH》：Intraperitoneal Copper–Manganese Nanozyme Suppresses Peritoneal Metastasis with Antitumor Immune Activation

　　

研究人员开发了一种铜-锰基纳米酶（CM），该酶将MnO₂介导的类Fenton（Fenton-like）催化与铜诱导的铜死亡（cuproptosis）相结合，用于结直肠癌（CRC）腹膜转移的腹腔内治疗。该纳米酶由嵌入无定形MnO₂中的CuO和Cu₂(OH)₃Cl晶域组成，水合动力学直径约为140 nm，并表现出过氧化物酶样、谷胱甘肽氧化酶、过氧化氢酶和类Fenton活性，可在模拟肿瘤条件下放大活性氧（ROS）。CRC细胞能高效内化该纳米酶，其可穿透三维球体，并通过ROS放大和铜死亡诱导强效、选择性细胞毒性。腹腔内递送CM可实现持久的腹腔滞留、显著减少腹膜肿瘤负荷和腹水，并重塑局部免疫微环境，激活抗肿瘤免疫应答。本研究为基于类Fenton ROS放大和铜死亡的CRC腹膜转移提供了一种有效的腔隙限制性治疗策略。

**论文解读：铜-锰纳米酶通过类Fenton催化与铜死亡协同抑制腹膜转移**

结直肠癌（CRC）腹膜转移是一种高度致死性的疾病进展模式，治疗选择极为有限。约8%–13%的CRC患者发生腹膜转移，一旦发生，中位总生存期仅约16个月。当前治疗策略主要依赖全身化疗和肿瘤细胞减灭术（CRS），部分患者联合腹腔热灌注化疗（HIPEC）。然而，仅少数符合严格手术标准的患者能接受此类大型手术，且即便完全减瘤，腹膜复发率可高达75%。HIPEC联合CRS增加围手术期并发症，近期随机试验未显示其明确的总体生存获益。腹腔化疗药物组织穿透有限、肿瘤结节灌注不良以及局部和全身毒性仍然是改善预后的主要障碍。因此，迫切需要安全有效且可重复给药的药物策略。纳米酶作为新兴工具，过渡金属氧化物纳米酶可模拟氧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽氧化酶活性，从而重塑肿瘤微环境的氧化还原稳态并放大活性氧（ROS）。含MnO₂的纳米酶可分解内源性H₂O₂、消耗谷胱甘肽（GSH），并在肿瘤弱酸性条件下催化类Fenton反应产生高毒性的羟基自由基。然而，腹膜转移灶的有限灌注和致密基质结构限制了常规化疗药物的暴露深度和均匀性。与此同时，新近发现的细胞死亡方式“铜死亡”由Cu⁺与三羧酸循环脂酰化成分直接结合触发，导致脂酰化蛋白聚集、铁硫簇蛋白丢失、蛋白毒性应激和最终细胞死亡。已有铜基纳米材料利用铜死亡进行癌症治疗，但多数研究在皮下或原位实体瘤中评估，尚未系统探索其对CRC腹膜转移的治疗潜力。为此，研究人员设计了一种铜-锰基纳米酶（CM），将MnO₂介导的类Fenton催化与铜驱动的铜死亡整合到单一腹腔注射纳米平台中，旨在实现有效的腔内治疗。该研究发表于《BIOMATERIALS RESEARCH》。

在技术方法方面，研究人员采用化学沉淀法合成CM，通过透射电子显微镜（TEM）、高分辨TEM（HRTEM）、能量色散X射线光谱（EDS）、X射线光电子能谱（XPS）、粉末X射线衍射（XRD）和动态光散射（DLS）进行了全面的理化表征。体外酶活性检测包括DCFH荧光法检测过氧化物酶样活性、DTNB法检测谷胱甘肽氧化酶活性、溶解氧电极检测过氧化氢酶活性以及TMB氧化法检测类Fenton活性。细胞系包括人胃癌MKN-45、人CRC DLD-1和Caco2、鼠结肠癌CT26及正常小鼠成纤维细胞L929，均由R. Luo和W. Sun提供，并遵循中山大学生物安全指南。动物实验使用雌性BALB/c小鼠（购自中山大学实验动物中心），通过腹腔注射CT26-luc细胞建立腹膜转移模型。体内外机制研究采用了JC-10染色、DCFH-DA染色、免疫荧光、Western blotting、流式细胞术和活体生物发光成像等关键技术。

在合成与理化表征方面，TEM显示CM呈“粒中粒”分级形貌，HRTEM在同一颗粒中识别出CuO（tenorite）和Cu₂(OH)₃Cl（atacamite）的晶格条纹以及无定形MnO₂区域，XRD证实其总体低结晶性。EDS元素图谱显示Mn、Cu、C、O、Cl均匀共定位，XPS确认了Cu(II)和Mn(IV)价态。DLS测得水合动力学直径为141.8 nm，多分散指数0.296，zeta电位为29.3±5.69 mV；在含血清溶液中粒径增至190.0 nm。pH依赖性释放实验表明，Mn和Cu在pH 5.0时释放显著增强，而在pH 7.4时释放有限，提示酸性环境下的响应性释放行为。

在肿瘤相关条件下的催化活性方面，CM在H₂O₂存在下表现出浓度依赖的过氧化物酶样活性，并通过DTNB实验显示GSH氧化酶样活性，消耗GSH。CM还显示出过氧化氢酶样活性，可分解H₂O₂产生O₂。TMB氧化实验表明，在pH 5.0时类Fenton活性最强，pH 6.4和7.4时较低，符合弱酸性肿瘤微环境激活的特性。动力学分析显示，CM的过氧化氢酶样活性表观K_m为337.6 mM，V_max为0.624 mM·s^?1；过氧化物酶样活性表观K_m为38 mM，V_max为4.02×10^?6 M·s^?1，与文献中代表性纳米酶相比具有较高的催化效率。

在细胞摄取与三维穿透方面，FITC标记的CM（FITC-CM）与CT26细胞共孵育后，荧光显微镜和流式细胞术显示时间依赖性细胞内积累，提示有效内化。在CT26多细胞肿瘤球中，共聚焦显微镜显示FITC荧光随时间从外周逐渐向内部扩散，48小时时均匀分布，证明CM可穿透致密的三维肿瘤结构。

在肿瘤选择性细胞毒性方面，CCK-8实验显示CM对MKN-45、DLD-1、Caco2和CT26均呈剂量依赖性杀伤，其中CT26最敏感（IC₅₀=15.49 μg/ml），而正常成纤维细胞L929在100 μg/ml时仍保持高活力（IC₅₀=366.8 μg/ml）。Calcein-AM/PI活死染色进一步证实该选择性毒性。基于敏感性和体内模型相关性，选用CT26进行后续机制和治疗实验。

在ROS放大与铜死亡机制方面，JC-10染色显示CM处理导致线粒体膜电位（MMP）剂量依赖性去极化，红绿荧光比值显著降低。DCFH-DA染色显示细胞内ROS水平升高，同时GSH检测显示细胞内GSH呈时间和剂量依赖性耗竭。免疫荧光检测到DLAT点状聚集体，且聚集面积随剂量增加而增加；Western blotting显示FDX1表达下调，去垢剂不溶性DLAT组分增加，符合铜死亡相关的蛋白毒性应激特征。

在体内安全性、腹腔滞留与生物分布方面，最大耐受剂量实验显示CM剂量≤20 mg/kg时小鼠体重稳定、无死亡，因此选定20 mg/kg为工作剂量。IVIS成像显示腹腔注射FITC-CM后，腹部荧光可持续至48小时，72小时基本消除；离体成像显示主要滞留于肠壁，且在腹膜转移模型中肿瘤结节处有强荧光信号。血清生化检测和主要器官H&E染色未显示明显毒性或组织损伤。

在抗肿瘤疗效与免疫重塑方面，CT26-luc腹膜转移模型中，CM组在治疗后第9天和第13天的生物发光强度显著低于PBS和奥沙利铂（OX）组（P<0.05）。大体解剖显示CM组小鼠腹膜肿瘤结节和腹水明显减少或消失，而PBS组出现广泛结节和腹水，体重增加与腹水积聚相关。组织学分析显示CM组肿瘤组织广泛坏死，Ki-67增殖指数显著降低。免疫荧光和流式细胞术显示，CM组肿瘤内CD8⁺ T细胞浸润显著增加（P<0.0001），腹腔中Foxp3⁺调节性T细胞（Tregs）显著减少（P<0.001），同时肿瘤内巨噬细胞M1/M2比例升高，CD86⁺ M1样巨噬细胞增加，CD206⁺ M2样巨噬细胞减少。

讨论部分指出，CM通过多路径氧化还原调节（包括H₂O₂处理、GSH消耗、O₂生成和酸性条件下类Fenton转化）协同放大氧化应激，并通过铜相关的线粒体功能障碍和DLAT聚集触发铜死亡。同时，CM的治疗效应延伸到免疫微环境重塑，表现为CD8⁺ T细胞富集、Treg减少和M1样巨噬细胞极化偏移，可能由氧化应激和线粒体损伤引发的炎症信号所驱动。CM在治疗方案下具有良好的腹腔耐受性，为重复给药提供了实际暴露窗口。

研究结论翻译：本研究开发了一种由结晶CuO和Cu₂(OH)₃Cl与无定形MnO₂均匀共定位构成的铜-锰纳米酶。CM被设计为整合肿瘤相关类Fenton氧化还原催化与铜驱动的线粒体蛋白毒性应激，从而将氧化损伤与铜死亡相关死亡程序相结合。在肿瘤细胞中，CM促进ROS积累，消耗硫醇抗氧化缓冲并破坏线粒体稳态，而正常成纤维细胞表现出显著更高的耐受性。这一整合机制在腹腔转移模型中转化为强劲的治疗疗效，与对照组相比，腹膜肿瘤生长和腹水相关负荷显著抑制。CM治疗还重塑了腹膜肿瘤微环境，表现为CD8⁺ T细胞浸润增加、Foxp3⁺ Treg富集减少以及巨噬细胞向M1主导表型偏移。CM在治疗方案下具有良好的腹腔耐受性，并提供了与重复给药兼容的实用暴露窗口。总之，这些发现将CM定义为一种腹腔纳米酶平台，偶联类Fenton催化治疗与铜死亡相关的线粒体破坏及免疫重编程，支持其作为腹膜转移潜在治疗策略的进一步开发。