MTR4缺陷通过MTR4-RAP1a轴抑制血管平滑肌细胞衰老从而减缓腹主动脉瘤进展

《iScience》：MTR4 deficiency attenuates abdominal aortic aneurysm progression through suppressing VSMC senescence via the MTR4-RAP1a axis

　　

腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是一种危及生命的血管疾病，以进行性主动脉扩张为特征，起病隐匿，但破裂后死亡率高，且治疗选择有限。血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）衰老是AAA进展的关键驱动因素。RNA解旋酶MTR4已被报道在心血管疾病中发挥作用，这为探索其主动脉病理功能奠定了基础。研究结果表明，MTR4在人和小鼠AAA组织中均显著上调。孟德尔随机化分析提示MTR4表达升高与AAA风险增加之间存在提示性因果关联。在体内，MTR4缺陷显著减轻了小鼠VSMC衰老并抑制了AAA形成。功能研究证实，MTR4通过调控RAP1a及其激活因子RASGRP2激活Rap1通路，从而促进VSMC衰老和AAA进展。RAP1a沉默消除了MTR4驱动的VSMC衰老。该研究将MTR4确定为AAA的潜在治疗靶点。

腹主动脉瘤（abdominal aortic aneurysm，AAA）是腹主动脉局部异常扩张形成的肿瘤样病变，主要危害包括破裂导致的大出血、血栓脱落引发的栓塞、器官缺血坏死及压迫周围组织造成的功能损害。由于起病隐匿，AAA常在出现严重并发症前无症状，而破裂是最致命的并发症，一旦发生死亡率极高，因此早期筛查、及时诊断和主动干预至关重要。近年研究发现，血管平滑肌细胞（VSMC）衰老可能影响AAA的形成，例如sirtuin 1（SIRT1）表达降低、myocardin相关转录因子A（MRTFA）表达增加、Krüppel样因子5（KLF5）缺失等均与VSMC衰老和AAA相关，但衰老诱导AAA的具体机制仍不明确。MTR4作为一种Ski2样RNA解旋酶，是RNA外泌体的关键组分，参与RNA监视和降解，此前研究提示其参与心肌损伤等心血管病理过程，但它在VSMC衰老和AAA中的精确病理生理作用尚不清楚。这项发表在《iScience》上的研究旨在探讨MTR4在AAA发病中的功能及其分子机制。

研究人员通过整合临床组织标本、孟德尔随机化（Mendelian randomization，MR）分析、体内基因敲除小鼠模型和体外VSMC实验，发现MTR4在人和小鼠AAA组织中均显著上调，且MTR4缺陷可减轻血管紧张素II（angiotensin II，Ang II）诱导的小鼠AAA形成，并抑制VSMC衰老。机制研究表明，MTR4通过激活Rap1信号通路，特别是通过正向调控RAP1a蛋白水平、负向调控RASGRP2表达，促进VSMC衰老和AAA进展。RAP1a沉默可逆转MTR4过表达驱动的促衰老效应，而RAP1a过表达可部分挽救MTR4敲低对衰老的抑制作用。该研究首次将MTR4-RAP1a轴与AAA发病联系起来，提示MTR4是AAA的潜在治疗靶点。

关键的技术方法包括：使用人AAA手术标本（6例男性患者）和非动脉瘤供体主动脉（3例）以及小鼠主动脉组织；通过ApoE^-/-小鼠高脂饮食联合Ang II皮下渗透泵输注建立AAA模型，并用C57BL/6J小鼠CaPO₄处理建立衰老相关AAA模型；利用MTR4^-/-小鼠与ApoE^-/-小鼠杂交获得双敲除小鼠；体外培养雄性SD大鼠主动脉VSMC。主要技术手段包括转录组测序（RNA-seq）、两样本孟德尔随机化分析、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、蛋白质印迹（Western blot）、免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色、酶联免疫吸附测定（ELISA）和免疫共沉淀（co-IP）等。

### MTR4在人和小鼠动脉瘤病变中上调

研究人员首先通过GEO数据库（GSE197748）的RNA-seq数据发现，AAA组织中MTR4转录本显著高于非动脉瘤主动脉。在人类手术标本中，免疫组化和免疫荧光证实MTR4在动脉瘤壁中高表达，且主要分布于中膜层。在Ang II诱导的ApoE^-/-小鼠AAA模型中，超声、组织病理学染色（HE、Masson、EVG）证实AAA成功诱导后，MTR4蛋白和mRNA水平均显著升高。共染实验显示MTR4主要与VSMC标志物α-SMA共定位，而与巨噬细胞标志物CD68共定位极少，提示MTR4的病理性上调主要发生在VSMC而非浸润的巨噬细胞。

### 孟德尔随机化分析MTR4表达与AAA风险

利用两样本孟德尔随机化框架，以GTEx v10主动脉eQTL为暴露数据、GWAS（GCST90475994）为结局数据，加权中位数估计法提示基因预测的MTR4表达升高与AAA风险增加存在正相关（OR = 1.07，95% CI 1.006–1.14，p = 0.032），但逆方差加权（IVW）法未达到统计学显著（OR = 1.03，95% CI 0.98–1.07，p = 0.277）。总体上，结果支持MTR4表达升高与AAA易感性之间存在提示性因果关联，但证据在不同MR估计方法间不完全一致。

### MTR4促进VSMC衰老

对Ang II处理的小鼠主动脉进行RNA-seq，发现16,889个上调转录本中5,149个与衰老相关，KEGG富集分析也支持衰老程序在动脉瘤形成中被激活。人和小鼠AAA组织中p16、p21、p53均显著上调；在衰老加速的CaPO₄诱导AAA模型中，老龄小鼠表现出更严重的弹性纤维断裂、管腔扩张和p16表达升高。人样本相关性分析显示MTR4与p16、p21、p53表达呈正相关。在体外，Ang II处理VSMC后，MTR4随时间上调，而增殖标志物PCNA下降，衰老标志物p53、p21、p16升高。此外，在ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化病变中，MTR4也上调并与α-SMA共定位，p16、p53表达趋势与MTR4一致，提示MTR4与VSMC衰老在不同血管病理中均存在关联。

### MTR4加剧Ang II诱导的AAA形成

为验证MTR4的功能，研究人员构建了ApoE^-/-MTR4^-/-双敲除小鼠并诱导AAA。与ApoE^-/-对照相比，MTR4敲除显著减少Ang II诱导的动脉瘤形成，EVG和Masson染色显示弹性蛋白降解和细胞外基质重塑明显减轻。Western blot和qRT-PCR证实MTR4缺失抑制了p16、p21的上调。体外实验中，MTR4敲低降低了VSMC中衰老标志物（p16、p21、p53）的基础水平并削弱Ang II诱导的衰老，SA-β-gal染色阳性细胞减少；MTR4过表达则增加SA-β-gal阳性细胞，与Ang II协同增强衰老表型。CCK-8实验显示MTR4敲低或过表达均不显著改变VSMC活力，表明MTR4主要调控衰老而非细胞死亡。

### MTR4通过Rap1信号通路促进VSMC衰老

对MTR4敲低后Ang II刺激的VSMC进行RNA-seq，KEGG富集分析显示Rap1信号通路是显著富集的通路之一。Western blot显示MTR4敲低降低RAP1a蛋白水平、升高RASGRP2水平，而MTR4过表达则相反。Actinomycin D实验显示MTR4不影响Rap1a mRNA稳定性，但co-IP证实MTR4与RAP1a蛋白存在相互作用，且敲低MTR4后相互作用减弱。Ang II时间梯度实验显示RAP1a表达渐进升高，而RASGRP2变化不明显。在AAA小鼠主动脉中，MTR4野生型动脉瘤组织RAP1a升高，MTR4敲除后显著抑制；RASGRP2在AAA中降低，但MTR4敲除未恢复其表达。功能上，RAP1a敲低显著抑制Ang II诱导的衰老标志物表达和SA-β-gal阳性细胞数；RAP1a过表达则增强Ang II诱导的衰老。在基因上位关系中，RAP1a沉默可逆转MTR4过表达的促衰老效应，RAP1a过表达可部分挽救MTR4敲低对Ang II诱导衰老的抑制作用。ELISA结果显示MTR4敲低降低IL-6和MMP-9分泌，RAP1a过表达可部分恢复。以上结果证明MTR4主要通过RAP1a激活Rap1信号通路驱动VSMC衰老。

### 讨论与结论

讨论部分指出，该研究首次报道MTR4在AAA病理中的功能，并揭示MTR4-RAP1a轴是驱动VSMC衰老的关键机制。MTR4作为RNA解旋酶，既可参与RNA外泌体介导的底物降解，也可能通过蛋白-蛋白相互作用对RAP1a进行翻译后调节，从而维持其蛋白水平。研究还观察到MTR4在动脉粥样硬化病变中上调，提示其可能作为多种年龄相关血管疾病的共性衰老调节因子。局限性包括未直接检测Rap1-GTP活化状态、体外单培养体系无法完全模拟体内多细胞环境、MTR4非依赖的RASGRP2调控机制尚存、临床样本量较小、仅使用雄性小鼠以及MR分析中IVW法未达显著等。尽管存在这些局限，研究结论为：MTR4通过MTR4-RAP1a轴调节VSMC衰老和AAA进展，是潜在的干预靶点。总之，本研究揭示了MTR4在调控VSMC衰老和AAA进展中的关键作用，为开发改善这种危及生命疾病患者预后的新疗法提供了理论基础。