《Aquaculture》：Grass carp RIOK1 promotes the degradation of IRF3 and IRF7 via distinct mechanisms to suppress IFN antiviral response
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摘要RIOKs（右开放阅读框激酶）对核糖体生物发生和细胞周期调控至关重要。最新证据表明RIOK家族成员参与宿主天然免疫反应，但草鱼RIOK1的具体机制尚未明确。我们发现，RIOK1在草鱼中呈组成性表达。RIOK1过表达显著抑制了IFN抗病毒应答并促进了病毒复制。在机制上，RI
摘要
RIOKs（右开放阅读框激酶）对核糖体生物发生和细胞周期调控至关重要。最新证据表明RIOK家族成员参与宿主天然免疫反应，但草鱼RIOK1的具体机制尚未明确。我们发现，RIOK1在草鱼中呈组成性表达。RIOK1过表达显著抑制了IFN抗病毒应答并促进了病毒复制。在机制上，RIOK1分别通过溶酶体和蛋白酶体依赖的途径促进IRF3和IRF7的降解，从而抑制IFN应答的激活。ATP结合位点突变体K207A和催化位点突变体D323A未能减少IRF3或IRF7的蛋白丰度，也未能抑制IRF3和IRF7触发的IFN应答，表明完整的ATP结合和催化残基是RIOK1发挥免疫抑制功能所必需的。与此一致，经riok1编辑且riok1表达量降低的细胞池表现出增强的IFN抗病毒应答和减少的病毒复制。在这些细胞中重新表达RIOK1逆转了增强的抗病毒表型并恢复了病毒易感性。总之，这些发现鉴定了草鱼RIOK1作为IFN抗病毒应答的负调控因子，并进一步支持了非典型激酶参与硬骨鱼天然免疫的观点。
引言
蛋白激酶分为真核蛋白激酶（ePKs）和非典型蛋白激酶（aPKs），它们调控多种细胞过程，包括增殖、代谢、凋亡和免疫应答（Castelo-Soccio等，2023；Manning等，2002；Pang等，2022）。右开放阅读框激酶（RIOK）家族构成aPKs中一个独特的群体，与传统ePKs的序列相似性有限（Castelo-Soccio等，2023；LaRonde-LeBlanc和Wlodawer，2005b）。在其成员中，RIOK1从古菌到人类高度保守，含有一个C末端RIO结构域，该结构域包含一个紧凑的催化核心以及参与ATP结合和催化的保守基序（LaRonde-LeBlanc和Wlodawer，2005a）。在结构上，存在于其他RIOKs中的翼状螺旋-转角-螺旋（wHTH）结构域在RIOK1中缺失，这一特征与真核RIOK蛋白中观察到的非互补功能一致（Ghandadi等，2024；Laronde-Leblanc等，2005）。尽管RIOK1在结构上与经典ePKs存在分歧，但它仍保留催化功能所需的关键残基。保守的赖氨酸残基有助于ATP配位，而保守的天冬氨酸残基参与催化和磷酸转移（Asquith等，2019）。相应地，哺乳动物RIOK1的D324A突变体已被广泛用作催化功能受损或显性负变异体（Handle等，2023；Jiang等，2024）。类似地，粪类圆线虫RIOK2催化天冬氨酸残基的突变（D228A）损害了其激酶活性，而ATP结合赖氨酸残基的突变（K123A）则导致明显的功能缺失表型，进一步证明了这些保守残基的功能重要性（Lei等，2017；Zhou等，2020）。RIOK1的机制研究主要集中于其在核糖体生物发生和细胞周期进程中的保守功能，在这些过程中，不同的RIOK家族成员发挥独特且非冗余的作用（Damizia等，2023；Ferreira-Cerca等，2012；Huang等，2025；Messling等，2022）。值得注意的是，最新证据表明RIOK蛋白还参与调控宿主抗病毒网络（Chen等，2018；Shen等，2021）。
与哺乳动物类似，干扰素（IFN）系统是鱼类抗病毒免疫的核心组成部分（Akira等，2006；Gan等，2019）。细胞内的视黄酸诱导基因-I（RIG-I）样受体（RLRs），主要为RIG-I和MDA5（黑素瘤分化相关基因5），识别病毒RNA并通过MAVS（线粒体抗病毒信号蛋白）传递信号。MAVS随后激活TBK1（TANK结合激酶1）、IKKε（IκB激酶ε）和经典IKK复合物。TBK1和IKKε磷酸化干扰素调节因子3和7（IRF3和IRF7），而经典IKK复合物激活NF-κB。这些转录因子随后诱导IFN和促炎细胞因子的表达（Onomoto等，2021；Yang等，2024）。分泌的IFN进一步刺激干扰素刺激基因（ISGs）的表达，其产物限制病毒复制并促进病毒清除（Sakai等，2021）。鉴于失控的IFN应答与自身免疫病理之间的联系，细胞必须对该信号通路进行精确而快速的调控（McNab等，2015）。值得注意的是，秀丽隐杆线虫RIOK1抑制p38 MAPK信号通路，从而调控天然免疫应答并维持免疫稳态（Chen等，2018）。此外，黄颡鱼的研究表明，包括RIOK1在内的RIOK家族成员下调鱼类IFN抗病毒应答（Liu等，2024；Zhao等，2023）。然而，RIOK1在草鱼中调控IFN信号的分子机制仍不明确。
草鱼（Ctenopharyngodon idella）是中国最重要的淡水养殖物种之一，但其养殖业的可持续发展持续受到病毒疾病的威胁（He等，2022）。阐明调控抗病毒免疫的分子机制对于理解宿主-病毒相互作用和制定有效的疾病防控策略具有重要意义。在此，我们的数据表明，草鱼RIOK1特异性地下调IRF3和IRF7触发的IFN应答并促进病毒复制。在机制上，RIOK1通过溶酶体途径促进IRF3的降解，通过蛋白酶体途径促进IRF7的降解。保守ATP结合残基（K207A）或催化残基（D323A）的突变消除了RIOK1减少IRF3和IRF7丰度及抑制相应IFN应答的能力，表明完整的ATP结合和催化残基是其免疫抑制功能所必需的。此外，经riok1编辑且riok1表达量降低的细胞池表现出增强的抗病毒应答和减少的病毒复制，而重新表达RIOK1逆转了这种抗病毒表型并恢复了病毒易感性。总之，这些发现鉴定了RIOK1作为硬骨鱼天然免疫的负调控因子，并揭示了一种非典型激酶差异性控制IRF3和IRF7稳定性的机制。本研究扩展了我们对RIOK蛋白免疫功能的认识，并为硬骨鱼的抗病毒研究和抗病育种策略提供了机制见解。
节段摘要
细胞、病毒和试剂
GCO（草鱼卵巢）细胞、HEK293T（人胚胎肾293T）细胞、春病毒性出血性败血病病毒（SVCV）和草鱼呼肠孤病毒I型（GCRV-I）在实验室中维持培养。细胞培养和病毒复制遵循已建立的方案（Qu等，2022）。GCRV-II由范以德教授（中国水产科学研究院淡水渔业研究中心）提供。
环己酰亚胺（CHX）、蛋白酶体抑制剂MG132以及溶酶体抑制剂NH4Cl和氯喹（CQ）。
草鱼RIOK1的序列分析
草鱼riok1基因编码一个由568个氨基酸组成的非典型蛋白。为研究其进化保守性，利用草鱼RIOK1及其来自多种物种的同源蛋白进行了多序列比对。比对结果显示，草鱼RIOK1与斑马鱼（D. rerio）RIOK1具有82.2%的氨基酸一致性，与小鼠（M. musculus）和人类（H. sapiens）同源蛋白的一致性分别为59.5%和57.8%（图1A）。同时，结构域分析进一步揭示了一个
讨论
与常规ePKs不同，RIO激酶缺乏典型激酶结构域所特有的经典激活环和底物结合位点（H?rmann等，2018）。尽管如此，RIOK1已被报道同时具有激酶和ATP酶活性，并从古菌到人类在进化上高度保守（Angermayr和Bandlow，2002；Ruan等，2025）。本研究的序列分析在草鱼RIOK1的RIO结构域中鉴定了一个保守的ATP结合基序和催化残基，
CRediT作者贡献声明
曲梓玲：撰写—初稿，调查，数据整理。岳华美：验证，数据整理。孔慧慧：调查，数据整理。黄玲：软件，调查。杨刚：软件，调查。阮瑞：验证，数据整理。叶欢：撰写—审阅与编辑，方法论，调查。李创举：撰写—审阅与编辑，监督，项目管理，构思。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本论文所报道工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本工作由中国农科院中央级公益性科研机构基本科研业务费专项资金（编号：2025XT0605、2022XT0301和2023TD23）及国家自然科学基金（编号：32303049）资助。
曲梓玲|岳华美|孔慧慧|黄玲|杨刚|阮瑞|叶欢|李创举
农业农村部淡水生物多样性保护重点实验室，中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，武汉 430223，中国
